人防御素6基因的克隆、亞克隆及在酵母中的分泌表達

單 穎 ， 吳學敏， 盧 穎

(遼寧醫(yī)學院 免疫學教研室，遼寧 錦州 121000)

人防御素6基因的克隆、亞克隆及在酵母中的分泌表達

單 穎 ， 吳學敏， 盧 穎

(遼寧醫(yī)學院 免疫學教研室，遼寧 錦州 121000)

探討人防御素6(HD-6)在畢赤酵母中表達的可行性，為進一步研究HD6的功能提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。采用PCR方法，設(shè)計引物從cDNA文庫中擴增出人α防御素6基因片段，并將其插入到克隆載體pMD-18T中，再與畢赤酵母表達載體pPICZαA重組，以得到重組的HD-6酵母表達載體pPICZαA/HD-6，并進行瓊脂糖電泳和測序鑒定。再將構(gòu)建好的畢赤酵母重組表達質(zhì)粒pPICZαA/HD-6經(jīng)SacⅠ線性化后，應(yīng)用LiCl法轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115感受態(tài)中，Zeocin平板篩選，PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。經(jīng)搖瓶發(fā)酵和甲醇誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析重組HD-6的表達。從cDNA文庫中擴增出的HD-6基因片斷大小正確；電泳和測序結(jié)果均證明已將此片段克隆到酵母表達載體pPICZαA內(nèi)；線性化的重組質(zhì)粒pPICZαA/HD-6成功轉(zhuǎn)化進入畢赤酵母感受態(tài)中，PCR鑒定結(jié)果與預(yù)期相符；蛋白電泳證實重組HD-6在酵母中獲得分泌表達。提示重組HD-6可以在畢赤酵母中實現(xiàn)分泌表達。

人防御素6；表達質(zhì)粒；畢赤酵母

人防御素(Defensin)屬于抗菌肽家族成員，是一類具有廣譜抗微生物活性的小分子陽離子多肽，分子內(nèi)均含有6個由二硫鍵連接的半胱氨酸，是機體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。根據(jù)其高級結(jié)構(gòu)及所含3對分子內(nèi)二硫鍵的連接方式不同，可將人類防御素分為2大類：α防御素和β防御素。α防御素主要存在于中性粒細胞(即髓源性防御素)和小腸潘氏細胞(即腸源性防御素)中。腸源性防御素包括HD-5和HD-6，主要分布于潘氏細胞和小腸上皮細胞[1-2]。近年來研究表明，腸源性防御素除了具有抗菌作用外，還具有抗病毒[3]作用，并且與一些消化系統(tǒng)疾病如炎癥性腸病有密切關(guān)系[4-5]。目前通過基因拼接和固相合成手段表達或生產(chǎn)出具有生物活性的HD-6已有報道，但這些手段成本高，操作繁瑣，而通過cDNA文庫擴增表達HD-6編碼基因至今未見報道。本研究旨在采用pPICZαA載體構(gòu)建HD-6基因酵母表達載體，并嘗試HD-6基因畢赤酵母的外源性表達，為大量生產(chǎn)和提純具有生物活性的人α防御素6抗菌肽方法的研究提供實驗基礎(chǔ)，以進一步探討HD-6的功能，并為用于消化系統(tǒng)疾病的治療創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 cDNA文庫 MegaMan Human Transcriptome Library購自STRATAGENE公司，包括66種不同的來源于人體組織及人腫瘤細胞cDNA片段，其中包括人小腸細胞的cDNA文庫。

1.1.2 菌株和載體 大腸埃希菌菌株DH-5α、Top10，畢赤酵母表達載體pPICZαA均由本教研室保存，克隆載體pMD-18T simple vector購自大連寶生物科技公司。

1.1.3 PCR引物設(shè)計和合成 上游引物：5′-CGGAATTCATGAGAACCCTCACCATCC-3′，下游引物：5′-GCTCTAGAGCGAGGCAGCAGAATCTGT-3′。上游引物中引入了EcoRⅠ，下游引物中引入了XbaⅠ的酶切位點。PCR引物由上海生工生物公司合成。

1.1.4 工具酶和主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ、ZeocinTM購自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、MarkerDL12000和DL4000、限制性內(nèi)切酶SacⅠ，均購自大連寶生物科技公司；LiCl、PEG3350、鮭魚精DNA購自北京拜爾迪公司；Lyticase 購自Sigma公司；AOX引物于上海生工生物公司合成。

1.2方法

1.2.1 目的基因的擴增 用PCR方法以cDNA文庫為模板，擴增HD-6序列。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性55 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)35次，再72 ℃后延伸10 min，產(chǎn)物經(jīng)電泳純化并回收。

1.2.2 克隆載體的構(gòu)建與鑒定 以pMD-18T為克隆載體，與HD-6的PCR產(chǎn)物連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH-5α，經(jīng)氨芐青霉素、X-Gal和IPTG培養(yǎng)基培養(yǎng)，進行抗生素和藍白斑雙重篩選。挑取白色菌落，經(jīng)菌液、質(zhì)粒PCR驗證獲得含有HD-6片段的陽性克隆pMD-18T-HD6。

1.2.3 畢赤酵母表達載體的構(gòu)建、鑒定 用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切pPICZαA質(zhì)粒和pMD-18T-HD6，瓊脂糖電泳回收2目的片段，用T4DNA連接酶將2目的片段連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10，經(jīng)Zeocin培養(yǎng)基篩選，挑取陽性克隆進行質(zhì)粒的小量制備，經(jīng)過PCR篩選獲得含有正確目的片段的陽性克隆。將陽性克隆質(zhì)粒進行測序。

1.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115 挑取經(jīng)分離純化的GS115菌落接種到50 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃搖菌過夜培養(yǎng)至OD600為0.8～1.0，離心收獲細胞，采用LiCl法制備感受態(tài)。分別加入50% PEG3350 240 μL、1 mol/L LiCl 36 μL、2 mg/mL超聲化單鏈鮭魚精DNA 25 μL，用SacⅠ單酶切并純化的重組質(zhì)粒DNA 50 μL，劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體完全分布均勻(約1 min)，30 ℃水浴孵育30 min，42 ℃水浴熱休克20 min，8 000 r/min離心收集酵母菌體，重懸酵母于1 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃搖床孵育4 h后，取100 μL菌液鋪選擇性培養(yǎng)基平板YPDZ(Zeocin 100 μg/mL)，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落長出情況并鑒定。

1.2.5 重組酵母菌的基因組提取及鑒定 接種重組轉(zhuǎn)化子于5 mL YPDZ培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3～5 d。室溫下，2 000 r/min離心10 min收集菌體，TE重懸，加入β-巰基乙醇3 μL，Lyticase 50 U，37 ℃水浴60 min，提取酵母菌基因組。以提取的基因組作為模板，用AOX引物和目的基因HD-6引物作PCR鑒定。

1.2.6 重組菌株的誘導(dǎo)表達及檢測 將PCR鑒定正確的重組酵母菌株接種到BMGY中，30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為2～6，室溫下4 000×g離心5 min，將菌體用BMMY重懸至OD600為1。28 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)，進行甲醇誘導(dǎo)表達，培養(yǎng)24 h，10 000×g離心5 min，將上清移入新的滅菌離心管中，進行SDS-PAGE電泳檢測，分析目的條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1目的基因的擴增

擴增的HD-6序列約為300 bp，PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示，在預(yù)期部位出現(xiàn)明顯條帶，結(jié)果見圖1。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Amplification of HD-6 by PCR

2.2克隆載體的構(gòu)建與鑒定

將HD-6片段克隆到載體pMD-18T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-18T-HD6，并經(jīng)過PCR鑒定，瓊脂糖電泳顯示PCR產(chǎn)物在300 bp左右出現(xiàn)條帶，與HD-6片段大小一致?？蛰d體pMD-18T在2 500 bp左右出現(xiàn)條帶，重組質(zhì)粒pMD-18T-HD6在3 000 bp左右出現(xiàn)條帶，均與預(yù)期位置相符，顯示與T載體連接成功，結(jié)果見圖2。

2.3畢赤酵母表達載體的構(gòu)建與鑒定

用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切pMD-18T-HD6，連接到同時進行此雙酶切的pPICZαA的位點中，構(gòu)建成酵母表達載體pPICZαA/HD-6，并經(jīng)過PCR鑒定，質(zhì)粒提取鑒定，均在預(yù)期部位出現(xiàn)條帶，結(jié)果見圖3。重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明HD-6基因序列為編碼目的基因的正確序列。

圖2 重組質(zhì)粒瓊脂糖鑒定結(jié)果Fig.2 Recombinant plasmid pMD-18T-HD6

圖3 重組質(zhì)粒pPICZαA/HD-6瓊脂糖電泳鑒定結(jié)果Fig.3 Recombinant plasmid pPICZαA/HD-6

2.4重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化結(jié)果

pPICZαA/HD-6線性化，氯化鋰轉(zhuǎn)化法進入GS115感受態(tài)，在Zeocin抗性的YPD平板上培養(yǎng)3～5 d得到數(shù)個抗性轉(zhuǎn)化菌落。

2.5重組酵母菌的基因組提取及PCR鑒定

隨機挑取5個重組子，分別接種于YPDZ中搖菌3～5 d，分別提取酵母基因組。以AOX上下游引物和目的基因HD-6引物PCR擴增，結(jié)果有3個菌落分別獲得大約830 bp和300 bp的正確產(chǎn)物條帶，結(jié)果見圖4。

圖4 重組酵母菌PCR鑒定結(jié)果 Fig.4 PCR identification of recombinant yeast

2.6SDS-PAGE分析

將重組酵母菌誘導(dǎo)表達的產(chǎn)物上清進行蛋白電泳，其結(jié)果與GS115空菌株進行對照，可見1條明顯的新生蛋白帶，其相對分子質(zhì)量為11 ku，同預(yù)期的大小相一致，結(jié)果見圖5。

圖5 畢赤酵母表達HD-6的SDS-PAGE電泳分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of expression of HD-6

3 討 論

抗生素耐藥一直是對全人類健康的一個威脅。由于人防御素是內(nèi)源性的而且具有廣譜抗菌性，因此它們是一類很有前景的治療候選藥物。防御素對革蘭陽性菌和陰性菌、真菌、分枝桿菌都有殺傷作用。然而生物機體內(nèi)天然的防御素含量很低，分離成本極高，使得防御素的利用受到極大限制，遠遠不能滿足人們的需要。而在大腸埃希菌等原核生物對防御素基因表達過程中，無法對其表達產(chǎn)物進行正確的空間結(jié)構(gòu)折疊修飾，影響了防御素的抗菌活性。通過轉(zhuǎn)基因工程手段也可從天然動植物中獲得較高效防御素的表達，但在大規(guī)模提取和分離純化中，所花成本極高，且工藝流程復(fù)雜，不利于進一步開發(fā)利用。因此利用近年開發(fā)的巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)勢，分泌型載體，構(gòu)建了HD-6畢赤酵母表達質(zhì)粒。

畢赤酵母表達體系是近年來發(fā)展最快、極具潛力的真核表達系統(tǒng)[6]，已成功地應(yīng)用于多種異源蛋白的表達[7-9]。由于它們屬于單細胞生物，營養(yǎng)要求低，培養(yǎng)基成分簡單、價廉，生長速度快，易于操作，可高密度發(fā)酵培養(yǎng)；可對蛋白進行翻譯后的加工、修飾和折疊。通過同源重組，表達載體可穩(wěn)定地整合到酵母宿主菌染色體中。選用酵母表達載體含有信號肽序列，可自動表達外源蛋白，且分泌至胞外，可有效防止外源基因表達產(chǎn)物對酵母菌生長可能產(chǎn)生的細胞毒性。

目前，人們對人髓源性防御素的基因、表達、翻譯后加工及抗菌機制等過程研究得較為透徹，然而對于腸源性防御素的研究較少，而且還存在很多疑問。腸源性防御素不僅抗菌譜廣，殺滅微生物作用強大，同時也可以作為免疫調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)機體免疫功能，對維持腸道屏障的完整性起到重要的作用[10]，且能解決其他抗菌藥物的耐藥性問題，逐漸在醫(yī)藥領(lǐng)域中展現(xiàn)了廣闊的開發(fā)前景。HD-6是屬于腸源性防御素中的一種[11]，關(guān)于它的功能及作用機制并不是很明確。本研究進行了畢赤酵母外源性表達HD-6蛋白，將表達產(chǎn)物的上清液做SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有特異條帶的出現(xiàn)，其相對分子質(zhì)量與預(yù)期值基本相符。提示HD-6可在畢赤酵母表達系統(tǒng)中進行外源性分泌表達。

雖然實現(xiàn)了HD-6蛋白在畢赤酵母中的分泌表達，但還需要對此蛋白表達產(chǎn)物進行進一步確認及純化，并檢測其是否具有生物活性，以進一步探討其功能及作用機制。

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·寫作常識·

引言

引言(也稱前言、序言或概述)經(jīng)常作為科技論文的開端，提出文中要研究的問題，引導(dǎo)讀者閱讀和理解全文。

1 引言的內(nèi)容

引言作為論文的開場白，應(yīng)以簡短的篇幅介紹論文的寫作背景和目的，以及相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)前人所做的工作和研究的概況，說明本研究與前人工作的關(guān)系，目前研究的熱點、存在的問題及作者工作的意義，引出本文的主題給讀者以引導(dǎo)。

引言也可點明本文的理論依據(jù)、實驗基礎(chǔ)和研究方法，簡單闡述其研究內(nèi)容；三言兩言預(yù)示本研究的結(jié)果、意義和前景，但不必展開討論。

2 引言的寫作要求

2.1 開門見山，不繞圈子。避免大篇幅地講述歷史淵源和立題研究過程。

2.2 言簡意賅，突出重點。不應(yīng)過多敘述同行熟知的及教科書中的常識性內(nèi)容，確有必要提及他人的研究成果和基本原理時，只需以參考引文的形式標出即可。在引言中提示本文的工作和觀點時，意思應(yīng)明確，語言應(yīng)簡練。

2.3 尊重科學，實事求是。在論述本文的研究意義時，應(yīng)注意分寸，切忌使用“有很高的學術(shù)價值”、“填補了國內(nèi)外空白”、“首次發(fā)現(xiàn)”等不適之詞；同時也要注意不用客套話，如“才疏學淺”、“水平有限”、“懇求指教”、“拋磚引玉”之類的語言。

2.4 引言的內(nèi)容不應(yīng)與摘要雷同，也不應(yīng)是摘要的注釋。引言一般應(yīng)與結(jié)論相呼應(yīng)，在引言中提出的問題，在結(jié)論中應(yīng)有解答，但也應(yīng)避免引言與結(jié)論雷同。

2.5 引言不必交待開題過程和成果鑒定程序，也不必引用有關(guān)合同公文和鑒定的全部結(jié)論。

2.6 簡短的引言，最好不要分段論述，不要插圖列表和數(shù)學公式的推導(dǎo)證明。

Clone,Sub-CloneandSecretionExpressionofHumanDefensin6GeneinPichiapastoris

SHAN Ying, WU Xue-min, LU Ying

(Teach&Res.Div.ofImmunol.,LiaoningMed.Coll.,Jinzhou121001)

The feasibility of expression of human defensin 6 (HD-6) inPichiapastoriswas investigated in order to provide theoretical foundation and experiment bases for further study on HD-6 function. A primer was designed, from cDNA library a fragment of α HD6 gene was amplified with PCR method. Then inserted it into HD-6 segment into a clone vector pMD-18T. Then recombine the α HD-6 fragment with expression vector pPICZαA to obtain a recombinant expression vector of pPICZαA/HD-6 and then identified by electrophoresis and sequence analysis. After the constructedP.pastorisrecombinant plasmid pPICZαA/HD-6 was linearized bySacⅠ, then was transformed into competenceP.pastorisstrains GS115, screened on Zeocin plate, then identified the transformant with PCR. Induced through shaker flask fermentation and alcohol, the expression of recombinant HD-6 was analyzed by SDS-PAGE. The PCR results of HD-6 gene from cDNA library had the correct size and sequences. The results of electrophoresis and sequencing had all proved that the fragment had been cloned into the expression vector plasmid pPICZαA. The linearized recombinant plasmid pPICZαA/HD-6 had successfully transformed into competenceP.pastoris. The PCR identified results accorded with the one expected. Protein electrophoresis had proved that recombinant HD-6 had obtained secretion expression inP.pastoris. Suggested that the HD-6 could be realized the secretion expression inP.pastoris.

human defensin 6 (HD-6); expression plasmid;Pichiapastoris

遼寧省自然科學基金(201202140)

單穎 女，副教授。研究方向為感染免疫。Tel:0416-4673251，E-mail:1822518917@qq.com

2013-05-03；

2013-12-02

Q93-3；Q78；R392

A

1005-7021(2014)03-0061-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2014.03.012