人支氣管上皮細(xì)胞中苯并芘誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)的分子機(jī)制

代佳，呂建祎，張敏，蔡秦真，高基民

（浙江省模式生物技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實驗室，溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州325035）

腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是TNF超家族中的一員，主要是由單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。同時，多種腫瘤細(xì)胞（肺癌細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌等）[1]也均可檢測到其表達(dá)。TNF-α是炎癥反應(yīng)中出現(xiàn)最早、最重要的炎性遞質(zhì)之一，與其受體TNFR（TNF-R1、TNF-R2）結(jié)合后，通過激活NF-κB、JNK和MAPK信號通路[2]，可調(diào)節(jié)細(xì)胞炎性和其他細(xì)胞反應(yīng)。而且越來越多的研究顯示，TNF-α可以通過促進(jìn)細(xì)胞增殖，血管生成和調(diào)節(jié)新陳代謝，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[3-5]。在全球，肺癌的發(fā)病率和病死率均居癌癥之首。研究[6]顯示90%的肺癌與吸煙相關(guān)。香煙中含有的苯并芘（B[a]P）及其代謝產(chǎn)物B[a]PDE是煙草中最重要、最強(qiáng)有力的肺致癌物質(zhì)[7]。B[a]P及B[a]PDE在慢性肺炎及肺部腫瘤的形成過程中發(fā)揮重要作用，而肺部炎癥的持續(xù)存在與肺癌的形成之間存在著緊密聯(lián)系[8-9]。

我們在人支氣管上皮細(xì)胞（Beas-2B）中研究了B[a]P對炎癥因子TNF-α mRNA表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。已有研究表明，TNF-α基因調(diào)節(jié)序列中包含轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B和AP1的結(jié)合序列[10-11]，說明了TNF-α轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的復(fù)雜性。實驗中將不同長度片段的TNF-α基因啟動子序列成功克隆入psiCHECK-2載體熒光素酶報告基因上游。并且發(fā)現(xiàn)24 h內(nèi)，B[a]P能夠通過促進(jìn)TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)TNF-α mRNA的表達(dá)，為以后更深一步地研究TNF-α在B[a]P誘導(dǎo)肺慢性炎癥至肺癌的發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗細(xì)胞 Beas-2B細(xì)胞由紐約大學(xué)黃傳書教授惠贈。

1.2 材料 B[a]P（Sigma）；DMEM培養(yǎng)基和FBS（GIBCO公司）；psiCHECK-2載體（上海吉瑪公司）；DH5α菌株（實驗室保存）；Trizol（Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程公司）；Power SYBR? Green PCR Master Mix（Applied Biosystems公司）；Dual-luciferase reporter Kit（Promega公司）；Lipofectamine? 2000 Reagent（Invitrogen公司）；T4 DNA連接酶、細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒、PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase、DL 2 000 DNA Marker、DL 10 000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶XholI、NotI均購自大連寶生物工程公司；Plasmid Miniprep Kit（天根生化科技有限公司）；Gel Extration Kit（上海捷瑞生物工程有限公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 Beas-2B細(xì)胞中TNF-α mRNA表達(dá)量的檢測：將Beas-2B細(xì)胞種于6孔板中，8 μ mol/L B[a]P處理不同的時間后，收集細(xì)胞，加入Trizol提取細(xì)胞總的RNA，將提取好的RNA在NANO DROP 2000儀器上測定其RNA濃度，且A260/A280為1.9～2.1。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，Real time-PCR檢測其中TNF-α mRNA水平隨B[a]P處理時間不同表達(dá)量的變化。Real Time-PCR所用引物見表1。

1.3.2 引物設(shè)計及其合成：自UCSC Genome Browser網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫檢索獲得TNF-α啟動子序列（見圖1），分別設(shè)計2段啟動子引物序列（見表2）。結(jié)合載體單克隆位點(diǎn)上的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和這2段啟動子序列的堿基情況，在上游引物5'端加入XholI的酶切位點(diǎn)CTCGAG，在下游引物5'端加入NotI的酶切位點(diǎn)GCGGCCGC。從轉(zhuǎn)錄起始零點(diǎn)開始，2段啟動子片段長度分別為：-2 000～+186（2 186 bp）和-1 000～+186（1 186 bp）。

表1 Real Time-PCR所用引物

圖1 人TNF-α基因啟動子DNA序列

表2 構(gòu)建人TNF-α基因啟動子區(qū)報告基因質(zhì)粒所用引物

1.3.3 TNF-α啟動子基因的克?。阂訠eas-2B細(xì)胞中提取的基因組DNA為模板，以UCSC網(wǎng)站獲得的TNF-α啟動子序列設(shè)計的引物，采用高保真酶Prime-STAR? GXL DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL：PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.4 μL，5×PrimeSTAR GXL Buffer（Mg2+Plus）4 μL，dNTP Mixture 1.6 μL，模板1 μL，分別取上游引物F1、F2和下游引物R各0.5 μL，加ddH2O至總體積20 μL。反應(yīng)條件：98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，56 ℃ 2 min，30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段擴(kuò)增結(jié)果，剩余的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，得到2段不同長度（2 186 bp和1 186 bp）的TNF-α基因啟動子片段。

1.3.4 TNF-α啟動子載體的構(gòu)建與測序：采用XhoI、NotI這2種限制性內(nèi)切酶對目的DNA片段和熒光素酶報告基因psiCHECK-2載體進(jìn)行37 ℃雙酶切5 h，酶切產(chǎn)物全部進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳回收純化目的片段?；厥盏拿盖挟a(chǎn)物用Nano Drop 2000測定其DNA濃度，按照目的基因與載體摩爾比1∶1的比例，在T4連接酶的作用下，于16 ℃連接12 h。連接產(chǎn)物以低溫CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于含50 mg/L氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)皿上，37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單克隆菌落，搖菌后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒用Xhol、NotI進(jìn)行雙酶切鑒定。同時，將提取的質(zhì)粒送華大基因公司進(jìn)行測序。

1.3.5 TNF-α啟動子載體轉(zhuǎn)染Beas-2B細(xì)胞：將構(gòu)建成功的2種重組質(zhì)粒psiCHECK-2-TNF-α-promoter1、psiCHECK-2-TNF-α-promoter2和空載體psiCHECK-2質(zhì)粒做轉(zhuǎn)化提取質(zhì)粒，Nano Drop 2000測定質(zhì)粒濃度。將Beas-2B細(xì)胞種于24孔板，按照Lipofectamine?2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。每孔分別定量加入psiCHECK-2-TNF-αpromoter1、psicheck2-TNF-α-promoter2質(zhì)粒和空載體psiCHECK-2質(zhì)粒0.8 μg、Lipofectamine? 2000 2 μL和無血清培養(yǎng)基100 μL。6 h后換含10% FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.6 報告基因活性的檢測：瞬時轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，每個樣本分3個復(fù)孔，每孔加75 μL的細(xì)胞懸液，再加入75 μL的Dual-Glo? Luciferase Reagent，混勻。25 ℃孵育10 min，待細(xì)胞充分裂解后，酶標(biāo)儀測量螢火蟲熒光值（Firefly Luc）。再向每孔中加入75 μL的Dual-Glo? Stop&Glo? Reagent，混勻。25 ℃孵育10 min，酶標(biāo)儀測量海腎熒光值（Renilla Luc）。計算Firefly Luc/Renilla Luc的比值，并以空載體psiCHECK-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞作對照，以判斷promoter1[psiCHECK-2-TNF-α-promoter1（2 186 bp）]和promoter2[psiCHECK-2-TNF-α-promoter2（1 186 bp）]2種啟動子的活性。

1.3.7 在B[a]P處理下TNF-α啟動子活性的檢測：Beas-2B細(xì)胞和293T細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染psiCHECK-2-TNF-α-promoter1、psiCHECK-2-TNF-α-promoter2重組質(zhì)粒和空載體psiCHECK-2后，用含1% FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h，加B[a]P刺激細(xì)胞不同時間長度（0、12和24 h）。收集細(xì)胞檢測其熒光數(shù)值，計算Firefly Luc/Renilla Luc的比值，統(tǒng)計B[a]P刺激下其啟動子活性的變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。組內(nèi)差異采用單因素方差分析，組間差異分析采用雙因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 B[a]P對TNF-α mRNA表達(dá)的影響 24 h內(nèi)，8 μmol/LB[a]P暴露下，Real time-PCR檢測Beas-2B細(xì)胞中的TNF-α mRNA的表達(dá)量呈升高趨勢（見圖2）。

圖2 8 μmol/L B[a]P暴露對TNF-α mRNA表達(dá)量的影響

2.2 TNF-α啟動子序列克隆 以Beas-2B細(xì)胞中提取的基因組DNA為模板，設(shè)計TNF-α不同位點(diǎn)的引物序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2段不同長度的TNF-α啟動子片段2 186 bp和1 186 bp（見圖3）。

圖3 TNF-α啟動子序列PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 TNF-α啟動子雙熒光素酶載體雙酶切鑒定及測序 將目的DNA片段和空載體psiCHECK-2（見圖4）進(jìn)行XhoI、NotI雙酶切后，膠回收得到相應(yīng)的條帶，在T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。提取的質(zhì)粒再經(jīng)XhoI、NotI雙酶切鑒定，2個重組質(zhì)粒分別釋放出2 186 bp和1 186 bp大小的DNA片段（見圖5）。華大基因測序比對測序結(jié)果證實2個質(zhì)粒包含2段相應(yīng)長短的TNF-α啟動子序列，測序鑒定正確。

圖4 psiCHECK-2載體圖譜

TNF-α啟動子重組質(zhì)粒：promoter1[psiCHECK-2-TNF-α-promoter1（2 186 bp）]和promoter2[psiCHECK-2-TNF-α-promoter2（1 186 bp）]重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖

2.4 TNF-α啟動子活性的檢測 將2個重組熒光素酶報告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到Beas-2B細(xì)胞中，檢測發(fā)現(xiàn)與對照質(zhì)粒相比，2個重組質(zhì)粒的熒光素酶活性均相對較高，表明2段啟動子序列均具有轉(zhuǎn)錄活性。而且，promoter1具有較高的啟動子活性。說明，2段序列均包含有TNF-α的啟動子部分（見圖6）。

圖6 TNF-α啟動子活性檢測

2.5 B[a]P對TNF-α啟動子活性的影響 熒光素活性檢測結(jié)果顯示，B[a]P暴露下，24 h內(nèi)，Beas-2B細(xì)胞中重組質(zhì)粒的熒光素活性呈升高趨勢（見圖7）。同時，在293T細(xì)胞中，B[a]P刺激也可以使重組質(zhì)粒的熒光素活性升高（見圖8）。由此可以得知，B[a]P能夠促進(jìn)TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄，promoter2活性比promoter1強(qiáng)，且沒有細(xì)胞特異型。

圖7 8 μ mol/L B[a]P暴露對Beas-2B細(xì)胞中TNF-α啟動子活性的影響

圖8 8 μmol/L B[a]P暴露對293T細(xì)胞中TNF-α啟動子活性的影響

3 討論

150年前，Virchow最初發(fā)現(xiàn)慢性炎癥和腫瘤之間存在著關(guān)聯(lián)[12]。大量研究證實，慢性炎癥是腫瘤發(fā)生的一個重要的原因。炎癥微環(huán)境促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，例如HBV病毒引起肝炎、肝硬化，最終發(fā)展為肝癌[13]；幽門螺旋桿菌引起胃炎、胃潰瘍，最終發(fā)展為胃癌[14]；HPV病毒引起宮頸炎、宮頸糜爛，最終發(fā)展為宮頸癌等[15]。

在腫瘤微環(huán)境中，TNF-α的持續(xù)產(chǎn)生是多種惡性腫瘤發(fā)生的標(biāo)志。同時，也可以作為腫瘤的預(yù)后指標(biāo)[1]。如果組織中TNF-α表達(dá)水平較高，則表示預(yù)后不良。由于TNF-α可通過與其受體TNFR結(jié)合發(fā)揮作用，且TNF-α受體能在上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。因此，TNF-α可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖及存活直接促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。同時，TNF-α也可以通過影響腫瘤微環(huán)境中的上皮細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞，間接促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。另外，腫瘤基質(zhì)細(xì)胞（包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）可以分泌多種炎癥因子（如TNF-α、IL-1和IL-6），這些細(xì)胞因子攻擊和招募更多的炎性細(xì)胞到達(dá)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)其增殖及存活能力。

已有的研究表明，TNF-α參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個進(jìn)程[16]。首先，TNF-α可以誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。一方面，TNF-α或TNF-α受體缺陷的小鼠對化學(xué)藥物誘導(dǎo)的皮膚癌的敏感性降低，而且很少發(fā)生轉(zhuǎn)移。在TNF-α基因缺陷的小鼠中，岡田酸和佛波酯也很難誘導(dǎo)皮膚癌的的發(fā)生。從以上可以看出，TNF-α的缺陷減緩了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。另一方面，TNF-α可以通過激活NF-κB、PKCα和AP-1信號通路，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在小鼠上皮JB6細(xì)胞中，TNF-α可以使NF-κB活性增強(qiáng)（以劑量依賴的方式），這在細(xì)胞惡變的過程中起著非常重要的作用[18]。其次，TNF-α可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力。TNF-α作為一個誘變劑，可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖及存活。TNF-α可以通過激活NF-κB，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活及增殖，也可以通過編碼NF-κB依賴的抗凋亡分子的生成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活[19]。另外，TNF-α不僅是一個自分泌生長因子，也可以誘導(dǎo)其他生長因子的表達(dá)（如EGFR和TNF-α），從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。第三，TNF-α能夠促進(jìn)腫瘤血管的生成。它可以通過調(diào)節(jié)多種血管生成因子，如IL-8、VEGF的表達(dá)，從而介導(dǎo)血管的形成。TNF-α也可以通過調(diào)控JNK和AP-1通路調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)[20]。另外，使用TNF-α的多克隆抗體可以完全中和TNF-α促進(jìn)血管生成的作用[21]。最后，TNF-α可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)化。在巨噬細(xì)胞中，TNF-α通過上調(diào)遷移抑制因子（MIF）誘NF-κ B和JNK信號通路的激活，促進(jìn)腫瘤的侵襲[22]。在腫瘤細(xì)胞中，TNF-α通過誘導(dǎo)MMPs和MMPsα/2β1整合蛋白的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。在纖維肉瘤組織中，TNF-α可以促進(jìn)腫瘤的肺轉(zhuǎn)移[23]。在一些腫瘤細(xì)胞中，TNF-α可以通過NF-κB依賴的方式誘導(dǎo)趨化因子受體CXCR4、化學(xué)誘變蛋白MCP-1、IL-8和細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)化[24-25]。因此，TNF-α可以通過其對腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境中的炎癥細(xì)胞的影響，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

大量研究報道，在非小細(xì)胞肺癌中，TNF-α在鱗癌和腺癌中的陽性表達(dá)率均較高[26-27]，說明在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，TNF-α作為一種重要的細(xì)胞因子參與，并發(fā)揮著重要作用。由于炎癥環(huán)境能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此炎癥的持續(xù)存在與癌癥的形成之間存在密切聯(lián)系。慢性間質(zhì)浸潤性肺部疾病包括各種各樣的疾病，通常從肺泡炎和/或細(xì)支氣管炎開始[28]。在粉塵誘發(fā)肺癌動物模型中，在晶體硅刺激下首先導(dǎo)致炎性肉芽腫的形成，之后 II型肺細(xì)胞和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞開始增生，后期腺瘤出現(xiàn)并最終導(dǎo)致腺癌或鱗狀細(xì)胞癌，證實炎癥與肺部腫瘤的發(fā)生有直接聯(lián)系[29]。研究證實，在A/J小鼠模型中，反復(fù)的B[a]P刺激可能導(dǎo)致肺部慢性炎癥，從而增加腫瘤的發(fā)生率[30]。

有研究報道，在Beas-2B細(xì)胞中，環(huán)境中的有毒物質(zhì)鎳可以通過調(diào)控TNF-α的啟動子活性從而誘導(dǎo)其表達(dá)，增加了肺癌發(fā)生的風(fēng)險性[31]。同時，還有研究顯示，在小鼠表皮Cl41細(xì)胞中，香煙中B[a]P的代謝產(chǎn)物B[a]PDE可以誘導(dǎo)TNF-α的表達(dá)，參與了小鼠皮膚癌的發(fā)生，并在其癌癥的進(jìn)展過程中也起著非常重要的作用[32]。

NF-κB是TNF-α信號通路中重要的信號分子，并在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，如：癌癥、哮喘、肌營養(yǎng)不良等。TNF可以通過IKK激酶復(fù)合體使IκBα蛋白的Ser32和Ser36或IκBβ蛋白的Ser19和Ser23 2個位點(diǎn)磷酸化，磷酸化的IκBα和IκBβ中的Lys21、Lys22泛素化，然后被S26蛋白酶復(fù)合體識別并迅速降解，使得NF-κ B的NLS暴露，進(jìn)入核內(nèi)起始轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)多種凋亡抑制因子的表達(dá)[33]。因此可以得出，TNF在調(diào)控NF-κ B信號通路過程中起著重要的作用，進(jìn)而影響了細(xì)胞的生存、增殖、分化以及死亡等細(xì)胞的多種生理病理性過程。

此項研究中，我們發(fā)現(xiàn)在B[a]P暴露下，24 h內(nèi)，Beas-2B細(xì)胞中TNF-α的mRNA表達(dá)量呈升高趨勢，并對其調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了初步探索。以Beas-2B細(xì)胞基因組為模板，構(gòu)建了包含不同長度片段的TNF-α啟動子序列的雙熒光素報告基因質(zhì)粒，成功檢測到Beas-2B細(xì)胞中啟動子的表達(dá)。而且，用8 μmol/L B[a]P處理轉(zhuǎn)染了2個重組熒光素報告基因質(zhì)粒的Beas-2B細(xì)胞后，24 h內(nèi)，2個重組質(zhì)粒的熒光素活性呈升高趨勢。為了證明B[a]P刺激細(xì)胞引起的這種變化有沒有細(xì)胞特異性，我們將重組質(zhì)粒又轉(zhuǎn)染了293T細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B[a]P作用于293T細(xì)胞后，2個重組質(zhì)粒的熒光素活性也會升高，說明沒有細(xì)胞特異性。由此可以得知，B[a]P能夠促進(jìn)TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)TNF-α mRNA的表達(dá)，且promoter1要比promoter2活性強(qiáng)。這為以后更深一步地研究肺癌組織中TNF-α與各個炎癥因子之間的相互關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制提供了有力的研究工具。