磷酸化mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1在浸潤性乳腺癌細胞中的定位表達研究

單美慧， 木扎帕爾·阿不都克熱木， 姚雪梅， 周 梅， 孫 剛， 馬斌林

(新疆醫(yī)科大學1附屬腫瘤醫(yī)院乳腺頭頸外科， 烏魯木齊 830011； 2公共衛(wèi)生學院流行病與統(tǒng)計學教研室, 烏魯木齊 830011 3附屬腫瘤醫(yī)院病理科, 烏魯木齊 830011)

乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。在中國的發(fā)病率每年以3%的速度增加，已經(jīng)成為中國女性最常見的惡性腫瘤[2]。mTOR(mammalian target of rapamycin雷帕霉素靶蛋白)信號通路參與調(diào)節(jié)與腫瘤密切相關的多項細胞功能如細胞增殖、細胞周期、蛋白合成、細胞遷移等，是近年來腫瘤研究的熱點，4EBP1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1真核細胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1)和S6K1(Ribosomal protein S6 kinase beta-1核糖體S6蛋白激酶1)是最廣泛研究的mTOR的底物。乳腺癌、前列腺癌、肺癌等許多腫瘤中都有mTOR信號通路的調(diào)節(jié)異常[3]。已經(jīng)有大量研究開始關注mTOR信號通路在乳腺癌中的應用[4-7]。腫瘤細胞中的某些分子在細胞中的定位可能與腫瘤的進展和預后相關。目前對于磷酸化mTOR信號及其下游分子在浸潤性乳腺癌細胞中的表達部位的研究較少，本研究對磷酸化mTOR及其下游分子p-4EBP和p-S6K1在浸潤性乳腺癌細胞中的表達部位進行探討。

1 資料與方法

1.1病例納入和排除標準納入標準：經(jīng)手術活檢證實為浸潤性乳腺癌，根治性手術治療后留有石蠟包埋的組織標本。排除標準：(1)患者術前接受過放療、化療或內(nèi)分泌治療。(2)腫瘤在外院已局部切除，我院無腫瘤標本。(3)男性乳腺癌和家族性乳腺癌。根據(jù)納入和排除標準，共納入285例乳腺癌患者。其中年齡≤45歲者157例，>45歲者128例；維吾爾族144例，漢族141例；乳腺原發(fā)腫瘤為T1者86例，T2～T4者174例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者161例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者124例，病理分期：Ⅰ期65例，Ⅱ～Ⅳ期220例；組織學分級：Ⅰ級8例，Ⅱ級205例，Ⅲ級72例。

1.2免疫組化方法

1.2.1 試劑、材料和設備 試劑:(1)一抗：p-mTOR (ser2448)購于Cell Signaling，貨號為2976，抗體來源為兔，多克隆抗體，適用于人；p-S6K1(thr389)購于ABCAM，貨號為ab32359，抗體來源為兔，單克隆抗體，適用于人、小鼠、大鼠；p-4EBP1(thr70)購于Millipore，貨號為NRG1691074，抗體來源為兔，單克隆抗體，適用于人。 (2)二抗：HRP標記抗兔二抗購于福州邁新生物(KIT 5006)。(3) 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液 pH7.4 。(4) 0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液pH6.0。 (5) DAB顯色液(GK346810)購于Gene Tech。材料：人的乳腺癌組織切片。設備：電子顯微鏡:日本OLYMPUS CX41，朗伽(網(wǎng)絡版)圖像分析軟件。

1.2.2 操作流程 (1)將石蠟切片置于烘箱中62℃烤2 h；(2)石蠟切片常規(guī)二甲苯，乙醇脫蠟至水，PBS洗5 min×3；(3)用0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液pH6.0煮沸熱修復(95℃ 20 min),室溫自然冷卻, PBS洗5 min×3;(4)滴加100 μL 3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶室溫孵育20 min；(5)PBS洗5 min×3；(6)10%新生胎牛血清室溫孵育20 min,(7)PBS洗5 min×3；(8)一抗(p-mTOR稀釋比例1∶100；S6K稀釋比例1∶50；4EBP1稀釋比例1∶100) 4℃ 孵育過夜，室溫復溫1 h；(9)PBS洗5 min×3；(10)二抗37℃孵育1 h；(11)PBS洗5 min×3；(12)DAB顯色1 s～10 min，顯色時間約8 s后放入ddH2O缸中終止實驗；(13)蘇木素復染30 s，用清水沖5 min，鹽酸酒精分化1 s，再用清水沖洗5 min；(14)脫水吹干后，樹脂封片； (15)鏡下觀察，細胞核呈紫藍色，陽性產(chǎn)物呈棕黃色或黃色。

1.2.3 染色結(jié)果的判斷 通過特異性抗原抗體反應，使細胞質(zhì)和(或)細胞核染色，陽性染色結(jié)果呈棕黃色，染色結(jié)果由2位病理科副主任醫(yī)師分別獨自判讀，對于不一致的判讀結(jié)果經(jīng)商討后得出一致結(jié)論。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。免疫組化各指標在癌組織與癌旁組織中表達部位的對比使用配對卡方檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

p-mTOR、p-4EBP1和p-S6K1在浸潤性乳腺癌及癌旁組織細胞中的染色定位結(jié)果如表1所示，在285例癌組織切片中，p-mTOR、p-4EBP1和p-S6K1的染色陽性例數(shù)分別為279例、161例和226例；在285例癌旁組織切片中，p-mTOR、p-4EBP1和p-S6K1的染色陽性例數(shù)分別為239例、81例和136例。p-mTOR 在癌組織中的表達定位在細胞核有1例，細胞漿有270例，核漿共表達有8例，在癌旁組織中的表達定位在細胞核有0例，細胞漿有234例，核漿共表達有5例，在癌組織與癌旁組織未見明顯統(tǒng)計學差異(P=0.554)； p-4EBP1在癌組織中的表達定位在細胞核有3例，細胞漿有45例，核漿共表達有113例，在癌旁組織中的表達定位在細胞核有1例，細胞漿有6例，核漿共表達有74例，癌與癌旁組織有顯著統(tǒng)計學差異(P=0.001)；p-S6K1在癌組織中的表達定位在細胞核有6例，細胞漿有0例，核漿共表達有130例，癌組織與癌旁組織有顯著統(tǒng)計學差異(P=0.000)。p-mTOR的表達部位主要定位于細胞漿，在癌組織和癌旁組織表達部位沒有明顯差異。而p-4EBP1和p-S6K1主要共同表達于細胞核和細胞漿，與癌旁組織相比，癌組織中單獨在細胞漿表達的幾率明顯大于癌旁組織，且差別有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)，見表1。

表1 p-mTOR、p-4EBP1 和 p-S6K1 在乳腺癌和癌旁組織中的表達部位

3 討論

一般認為，mTOR主要存在于細胞漿或細胞膜處。很少有研究比較mTOR磷酸化后是否也是同樣的情況。有研究發(fā)現(xiàn)，在人類惡性腫瘤細胞系的成纖維細胞以及小數(shù)成肌細胞中，mTOR主要位于細胞核；而在HEK293細胞中，mTOR卻從細胞核釋放出來[8]。HEK293 和 Rh30 橫紋肌肉瘤混合培養(yǎng)體中，mTOR主要分布在細胞核，但是在細胞漿中也能被檢測到。雖然mTOR蛋白可以在細胞核和細胞漿中來回穿梭[9]，本研究結(jié)果卻顯示，無論在乳腺癌組織還是癌旁組織，p-mTOR主要定位于細胞漿，在細胞核和細胞漿中共表達或單獨表達于細胞核的情況很少。這與Penelope等[10]的報道中極為相似，認為mTOR主要定位于細胞漿或者細胞膜上，但偶爾也會在細胞核中出現(xiàn)。還有研究認為mTOR進入細胞核可能對激活其細胞漿信號傳導有很大作用[11]。

4EBP1 和S6K1也是一種可以在細胞漿、細胞核之間穿梭的蛋白[12-13]。S6K1在細胞核中被mTOR激活，而mRNA翻譯開始以后又重新分布進入細胞漿，因而許多研究報道在細胞核和細胞漿中均能檢測到p-S6K1[11,14]。本研究p-4EBP1 和 p-S6K1均主要共表達于細胞核和細胞漿中。然而與癌旁組織相比有統(tǒng)計學差異的是，在乳腺癌組織中，兩者單獨在細胞漿表達的幾率明顯高于核-漿共表達，提示p-4EBP1和p-S6K1單獨在細胞漿中的表達與乳腺細胞惡性轉(zhuǎn)化有關，也可能與乳腺癌的進展和預后有關。這在最近的一些研究中可以得到證實。Elin 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，p-4EBP1在細胞漿的高表達與腫瘤的高組織學級別、Her-2陽性以及腫瘤大小較大有關。p-4EBP1在細胞核中的表達與腫瘤較小、低組織學級別有關。p-4EBP1在細胞漿高表達還是一個獨立預后因素，能夠預測無遠處復發(fā)生存率下降和乳腺癌生存率較差。p-4EBP1在細胞核中的表達與預后無關，但是細胞核高表達提示預后較好，在PR陽性亞組中更加顯著。Elin等[15]還發(fā)現(xiàn)， S6K1在細胞核染色與ER(P=0.000 9)具有很好的相關性。S6K1在細胞漿的表達與高組織學級別和預后較差有關，尤其是在雌激素受體陽性的亞組；S6K1在細胞漿中的表達是乳腺癌的一個獨立預后因素，可預測未接受系統(tǒng)治療的乳腺癌患者具有復發(fā)風險增加以及較差的生存率。在ER陽性亞組中，這種預測作用更強，S6K1在細胞核中表達明顯增加比在細胞漿中表達更能顯示出對他莫昔芬療效不好的關系。此外，Li等[16]對胃癌組織的研究也發(fā)現(xiàn)，p-S6K1在細胞核表達下調(diào)與胃癌的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移有關，還有可能被用于解釋胃癌在臨床病理學方面的生物學行為。

綜上所述，mTOR信號通路中p-4EBP1 和 p-S6K1在浸潤性乳腺癌細胞漿中表達升高與乳腺癌的發(fā)生可能相關，通過進一步研究乳腺癌組織中p-4EBP1和p-S6K1在細胞中定位表達與各臨床病理學因素及患者生存指標之間的相互關系，對于臨床上提示乳腺組織惡變或乳腺癌組織的惡性程度有一定的指導意義。

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