沈興婭 張好為 趙廣明 魏賀璽 楊立順
改良瑞-姬氏染色法的染色效果研究
沈興婭 張好為 趙廣明 魏賀璽 楊立順
目的 研究改良瑞-姬氏染色法的染色效果。方法采用傳統(tǒng)與改良瑞-姬氏染色法對40例精液標(biāo)本進(jìn)行染色,觀察改良瑞-姬氏染色對精子、精液細(xì)胞及陰道分泌物的染色效果。結(jié)果改良瑞-姬氏染色下的中段缺陷精子率[(7.02±2.4)%vs(5.48±2.8)%]及尾部缺陷精子率[(11.02±2.03)%vs 8.05±2.56)%]高于傳統(tǒng)的瑞-姬氏染色(P<0.05)。兩方法的正常形態(tài)精子率及頭部缺陷精子率的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但是染色效果不同,改良方法下精子可見明顯頭核的深染和頂體的突出,而傳統(tǒng)方法染色效果較模糊。改良瑞-姬氏染色下的精液細(xì)胞及陰道分泌物中細(xì)胞及滴蟲等成分染色效果良好,陰道毛滴蟲的鞭毛和軸柱結(jié)構(gòu)尤其清晰。結(jié)論改良瑞-姬氏染色法染色過程簡單、效果好、實用,值得臨床推廣應(yīng)用。
精子;陰道涂片;毛滴蟲,陰道;染色與標(biāo)記;改良瑞-姬氏染色法
目前,用臨床常用的瑞氏染色和瑞-姬氏染色進(jìn)行精子染色的效果均不是很理想。黃宇峰等[1]采用經(jīng)過洗滌3遍后的精子再進(jìn)行傳統(tǒng)瑞-姬氏染色,能夠觀察到較理想的精子形態(tài),但由于操作煩瑣、用時較長,在洗滌過程中會損失部分尾部缺陷的精子,又不適用于不液化精液。本研究對瑞-姬氏染色進(jìn)行改良后用于精液染色,在標(biāo)本處理上直接涂片染色無需洗滌,節(jié)約了時間;在試劑配置上調(diào)整了緩沖液的pH值,優(yōu)化了染色程序,現(xiàn)報告如下。
1.1 標(biāo)本來源 40份精液標(biāo)本來源于2010年3月—8月在我院泌尿生殖科做常規(guī)精液檢查的患者,陰道分泌物來源于本院婦科門診。
1.2 試劑配置 瑞氏染液:瑞氏染料1 g,加入500 mL甲醇溶液中,倒置混勻后,放置37℃培養(yǎng)箱內(nèi),每天倒置混勻2次,1周即可使用。吉姆薩染液:吉姆薩染料0.5 g,置于33 mL甘油中,60℃水浴2 h使其溶解,再加60℃預(yù)熱的甲醇33 mL混合后置棕色瓶內(nèi),室溫下放置數(shù)日后方能使用。緩沖液:傳統(tǒng)瑞-姬氏染色用pH 6.9磷酸鹽緩沖液。改良瑞-姬氏染色用pH7.0磷酸鹽緩沖液,0.1 mol/L KH2PO430 mL+0.1 mol/L Na2HPO470 mL,混勻。
1.3 方法 每份精液標(biāo)本制作涂片2張,分別按照傳統(tǒng)和改良瑞-姬氏染色法進(jìn)行染色,由本科室經(jīng)過培訓(xùn)的2名技師,進(jìn)行WHO推薦的精子形態(tài)學(xué)分類(多重精子缺陷指數(shù)),要求至少計數(shù)200個精子,互相復(fù)檢取均值。陰道分泌物只采用改良瑞-姬氏染色法進(jìn)行染色并鏡檢。
1.3.1 改良瑞-姬氏染色法 將精液或分泌物涂片放在染色架上,滴加瑞氏染液5滴,加pH7.0磷酸鹽緩沖液10滴,混勻,再加吉姆薩染液2滴,輕輕搖動2 min,染色20 min。流水緩慢沖洗1 min,放入95%乙醇中1 s,脫掉浮色,流水緩慢沖洗1 min。待干,加中性樹膠,用50 mm×24 mm蓋玻片封片,置光鏡油鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。
1.3.2 傳統(tǒng)瑞-姬氏染色法 參照文獻(xiàn)[2]中的方法對精液進(jìn)行傳統(tǒng)瑞-姬氏染色。
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,均數(shù)間比較用配對t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 兩種染色方法對精子染色形態(tài)的評估 改良瑞-姬氏染色法下的中段缺陷精子率和尾部缺陷精子率高于傳統(tǒng)瑞-姬氏染色(P<0.05),但兩種方法的正常形態(tài)精子率和頭部缺陷精子率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,見表1。
Tab.1 Morphological evaluation of sperm stained by two methods表1 兩種染色方法對精子形態(tài)的評估 (n=40,%,±s)
Tab.1 Morphological evaluation of sperm stained by two methods表1 兩種染色方法對精子形態(tài)的評估 (n=40,%,±s)
*P<0.05
方法改良瑞-姬氏染色法傳統(tǒng)瑞-姬氏染色法t正常形態(tài)精子率25.2±5.4 25.5±4.6 0.51頭部缺陷精子率72.4±8.9 71.3±10.6 0.63中段缺陷精子率7.02±2.4 5.48±2.8 4.58*尾部缺陷精子率11.02±2.03 8.05±2.56 6.21*
2.2 兩種染色方法對同一份精液進(jìn)行染色的效果 改良瑞-姬氏染色下的正常形態(tài)精子,精子頭核及頂體清晰,隱約可見赤道板,精子中段較尾部稍粗,可見中段小節(jié),并可清晰看出尾部末梢,見圖1A。傳統(tǒng)瑞-姬氏染色所示精子中段和尾部幾乎不能著色,圖1B。
2.3 改良瑞-姬氏染色下的缺陷精子觀察 對于缺陷精子,改良瑞-姬氏染色也能獲得很好的染色效果,見圖2。
2.4 改良瑞-姬氏染色下的精液細(xì)胞 改良瑞-姬氏染色各階段生精細(xì)胞核染色質(zhì)、核膜、胞漿和細(xì)胞膜均染色清晰,見圖3。
2.5 改良瑞-姬氏染色下的陰道分泌物涂片結(jié)果 改良瑞-姬氏染色對陰道分泌物中的白細(xì)胞、白色念珠菌(菌絲和孢子)、陰道毛滴蟲及線索細(xì)胞都有很好的染色效果,見圖4~6。
3.1 2種方法對精子形態(tài)的評估 改良的瑞-姬氏染色法對精子的中段和尾部著色清晰,可見中段小結(jié)。缺陷精子的檢出率高于傳統(tǒng)的瑞-姬氏染色,這一結(jié)果和石亮等[3]的研究結(jié)果一致。雖然2種方法的頭部缺陷精子率無明顯差異,但染色效果不同,改良方法下可見明顯頭核的深染和頂體的突出,而傳統(tǒng)方法染色效果較模糊。
3.2 改良瑞-姬氏染色對陰道分泌物的著色 臨床實驗室對陰道分泌物的檢測有直接涂片鏡檢法及染色鏡檢法,采用的染色方法有革蘭染色、瑞氏染色、瑞-姬氏染色等。研究發(fā)現(xiàn)染色檢出的滴蟲、真菌、線索細(xì)胞陽性率明顯高于懸滴法[4]。本研究發(fā)現(xiàn)改良瑞-姬氏染色法對陰道分泌物中的滴蟲、真菌、桿菌、球菌、線索細(xì)胞都有很好的染色效果,尤其是陰道毛滴蟲的軸柱和鞭毛清晰可見,與蘇水蓮等[5]對陰道毛滴蟲的染色相比,本研究的方法著色力好,染色時間短。
3.3 改良瑞-姬氏染色法著色力強(qiáng)的原因分析 精子染色方法的基本原理是染料中帶正電荷的堿性染料與帶負(fù)電荷的核酸相結(jié)合使精子細(xì)胞核染色,酸性染料則將胞漿中帶相反電荷的蛋白質(zhì)染色[6]。改良瑞-姬氏染色法著色力強(qiáng)的原因首先是程序的優(yōu)化,其先混和瑞氏染液和緩沖液,緩沖液不僅提供了合適的pH環(huán)境,還起到稀釋的作用,使瑞氏染料滲透到細(xì)胞內(nèi)而加速核的著色,使精子的頂體、頭核染色良好,后加姬氏染液染胞漿,使得精子的中段和尾部染色清晰。其次是緩沖液pH值的改變,通過多次試驗,緩沖液pH7.0的染色效果優(yōu)于傳統(tǒng)的pH6.9。根據(jù)等離子狀態(tài)染色學(xué)說,適宜pH值的染浴條件,保證細(xì)胞大部分成分處于等電點附近著色是至關(guān)重要的。而精液pH值的正常范圍是7.2~8.0,pH7.0更接近精液的pH值。最后是染液比例的改變,傳統(tǒng)方法瑞氏染液與姬氏染液的染色比例是10∶1,而改良后比例為5∶2。改良法提高了染胞漿的姬氏染料,所以精子中段和尾部末梢染色良好,中段小結(jié)清晰可見。適宜的pH環(huán)境、適當(dāng)?shù)娜疽罕壤?、?yōu)化的程序一起共同作用,使改良瑞-姬氏染色法的染色效果優(yōu)于傳統(tǒng)瑞-姬氏染色法。
Fig.1 Sperm stainingusing Improved and traditional Wright-Giemsa staining(×1 918)圖1 改良和傳統(tǒng)瑞-姬氏染色下的精子(×1 918)
Fig.2 Defective sperm after Wright-Giemsa staining(×1 918)圖2 改良瑞-姬氏染色缺陷精子(×1 918)
Fig.3 different stages of spermatogenic cells Wright-Giemsa staining (×1 843)圖3 改良瑞-姬氏染色各階段生精細(xì)胞(×1 843)
Fig.4 The hypha and spore of Candida albicans(A)and Trichomonas vaginalis(B)(×1 918)圖4 白色念珠菌菌絲和孢子(A)及陰道毛滴蟲(B)(×1 918)
Fig.5 Lactobacilli(A)and sphaerita(B)(×1 918)圖5 乳酸桿菌(A)和球菌(B)(×1 918)
Fig.6 Clue cells(×1 918)圖6 線索細(xì)胞(×1 918)
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(2014-01-20收稿 2014-03-12修回)
(本文編輯 閆娟)
Study of the Effects of Improved Wright-Giemsa Staining
SHEN Xingya,ZHANG Haowei,ZHAO Guangming,WEI Hexi,YANG Lishun
Beichen District Chinese Medicine Hospital,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300400,China
ObjectiveTo study the effects of improved Wright-Giemsa staining.Methods40 semen samples by both traditional and improved Wright-Giemsa staining.The morphological characteristics stained by two methods was observed.ResultsThe defective rates of the middle and tail parts of sperm were 7.02%±2.4%and 11.02%±2.03%respectively in improved staining group;while those were 5.48%±2.8%and 8.05%±2.56%in traditional staining group.There was statistical significance between two staining methods(P<0.05).There was no significant difference of normal sperm and sperm head between these two staining methods;however,improved staining method showed a much clearer nucleus and acrosome staining than that of traditional methods.Improved Wright-Giemsa staining is better for sperm,vaginal discharge and Trichomonas vaginalis.More importantly,axostyle and flagella were clearly stained with the improved method.ConclusionImproved Wright-Giemsa staining is simple and can be used in clinical diagnosis.
spermatozoa;vaginal smears;trichomonas vaginalis;staining and labeling;improved wright-giemsa staining
R329-33
A
10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.023
天津市北辰區(qū)計劃外項目自選課題(20121007)
天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬北辰中醫(yī)院(郵編300400)