Vav-Cre介導(dǎo)的YFP報(bào)告基因系統(tǒng)標(biāo)記小鼠NK細(xì)胞的特異性和效率檢測

李丹丹孟歆懌雷 蕾尹 潔王 璽張 玲△

實(shí)驗(yàn)研究

Vav-Cre介導(dǎo)的YFP報(bào)告基因系統(tǒng)標(biāo)記小鼠NK細(xì)胞的特異性和效率檢測

李丹丹1孟歆懌2雷 蕾2尹 潔2王 璽2張 玲1△

目的 探索Vav-Cre介導(dǎo)的黃色熒光蛋白（YFP）報(bào)告基因系統(tǒng)標(biāo)記小鼠體內(nèi)自然殺傷（NK）細(xì)胞的特異性和效率。方法通過基因型分型篩選ROSA26R-YFP與Vav-Cre小鼠雜交后代中雙陽性基因型小鼠，流式細(xì)胞術(shù)分析免疫器官淋巴結(jié)、脾、胸腺以及骨髓細(xì)胞的YFP表達(dá)效率，通過細(xì)胞表面抗體標(biāo)記淋巴結(jié)、脾及骨髓的NK細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析NK細(xì)胞群體中YFP陽性細(xì)胞百分比。結(jié)果ROSA26R-YFP與Vav-Cre小鼠雜交后代共17只，雙陽性基因型小鼠（ROSA26R-YFP（+/-）Vav-Cre）11只；流式細(xì)胞術(shù)分析淋巴結(jié)、脾、胸腺、骨髓細(xì)胞中YFP陽性細(xì)胞的百分比（％）分別為73.87±1.51、56.07±1.47、86.17±1.74、53.60±3.56，陰性對照組相應(yīng)器官分別為0.27± 0.01、1.33±0.91、0.11±0.01，0.29±0.03，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），兩種類型小鼠非免疫器官腎中均無明顯YFP表達(dá)（雙陽性鼠0.72％±0.43％，對照鼠0.92％±0.27％，P＞0.05）；淋巴結(jié)、脾和骨髓中NK細(xì)胞YFP陽性百分比（％）76.94±0.84、81.66±1.18、88.92±0.77，與陰性對照組比較均明顯增高（均P＜0.01）。結(jié)論Vav-Cre介導(dǎo)的YFP報(bào)告基因系統(tǒng)標(biāo)記小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞具有特異性及高效性。

殺傷細(xì)胞,天然；免疫系統(tǒng)；基因,報(bào)告；小鼠,轉(zhuǎn)基因；雜交,遺傳；黃色熒光蛋白；Cre重組酶

自然殺傷（NK）細(xì)胞是一群不同于T細(xì)胞、B細(xì)胞的大顆粒淋巴細(xì)胞[1]，可通過釋放顆粒物和細(xì)胞因子直接殺傷腫瘤和受病原微生物感染的細(xì)胞，是免疫治療及各種腫瘤治療研究的新熱點(diǎn)[2]，但其發(fā)育分化機(jī)制尚不明確。利用基因敲除小鼠研究NK細(xì)胞發(fā)育是非常有效的手段。Vav-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠是介導(dǎo)造血系統(tǒng)特異性基因敲除的常用工具鼠[3]，但基因敲除效率的檢測具有一定局限性。本研究引入ROSA26R-YFP熒光報(bào)告基因小鼠，與Vav-Cre小鼠雜交，通過黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）表達(dá)對造血系統(tǒng)中Vav-Cre表達(dá)的特異性及NK細(xì)胞被YFP標(biāo)記的效率進(jìn)行檢測，旨在構(gòu)建特異性YFP報(bào)告系統(tǒng)，為研究NK細(xì)胞的發(fā)育和功能提供理想平臺。

1 材料與方法

1.1 材料 ROSA26R-YFP轉(zhuǎn)基因小鼠、Vav-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠（哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)）；C57BL/6小鼠（國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心）；鼠尾裂解液（20 mmol/L Tris-Cl pH 8.0；5 mmol/L EDTA pH 8.0；400 mmol/L NaCl；1％SDS）；20 g/L蛋白酶K；EasyTaq DNA聚合酶（Transgen）；引物由上海生工合成，序列見表1。FBS（Gibco）；Veriti PCR儀（ABI公司）；Tanon-1600全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀、熒光標(biāo)記抗體Percp-CD3e、PE-CD122、APC-NK1.1（BD公司）。

Tab.1 The genotyping primers of Cre and YFP genes表1 Cre和YFP基因的鑒定用引物序列

1.2 方法

1.2.1 基因型鑒定 ROSA26R-YFP(+/+)小鼠與Vav-Cre小鼠雜交，后代在出生10 d后剪腳趾進(jìn)行編號，剪鼠尾進(jìn)行基因型鑒定。鼠尾在含有500 μL裂解液和10 μL蛋白酶K的離心管中55℃，振蕩裂解14 h；裂解液加入300 μL飽和NaCl水溶液，冰上靜置15 min；4℃、12 000 r/min離心15 min，上清轉(zhuǎn)入新離心管；異丙醇沉淀DNA，4℃、12 000 r/min離心5 min；75％乙醇洗滌；風(fēng)干后加50 μL雙蒸水溶解DNA，Nanodrop 2000測濃度；按照EasyTaq DNA聚合酶試劑盒說明進(jìn)行PCR：95℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠電泳，數(shù)碼凝膠成像儀下觀察。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測YFP表達(dá) 頸椎脫臼處死ROSA26R-YFP(+/-)Vav-Cre基因型和C57BL/6小鼠，分別取2種小鼠的淋巴結(jié)、脾、胸腺、骨髓和腎，于盛有PBEF（PBS緩沖液+2 mmol/L EDTA+2％FBS）溶液培養(yǎng)皿中研磨，細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞術(shù)分析YFP表達(dá)情況（每管分析50 000細(xì)胞），F(xiàn)lowJo 7.6.1軟件分析。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測YFP標(biāo)記NK細(xì)胞的效率 按照1.2.2方法處理 ROSA26R-YFP(+/-)Vav-Cre基因型和C57BL/6小鼠，細(xì)胞計(jì)數(shù)；C57BL/6小鼠淋巴結(jié)、脾和骨髓的細(xì)胞懸液100 μL，加入PBEF溶液稀釋至1 mL，待流式分析時(shí)調(diào)節(jié)電壓；ROSA26R-YFP(+/-)Vav-Cre基因型小鼠脾細(xì)胞懸液100 μL，PBEF溶液稀釋至1 mL，標(biāo)記為SP1，另取3管C57BL/6鼠的脾細(xì)胞懸液100 μL分別加入熒光標(biāo)記抗體2.5 μL Percp-CD3e、1.5 μL PE-CD122、1.5 μL APC-NK1.1，4℃避光反應(yīng)30 min，4℃、1 500 r/min離心5 min，1 mL重懸，避光轉(zhuǎn)入流式管，標(biāo)記為SP2、SP3、SP4，與SP1同時(shí)待流式分析時(shí)調(diào)節(jié)補(bǔ)償；最后分別取2種小鼠淋巴結(jié)、脾和骨髓細(xì)胞懸液100 μL，每管均加入2.5 μL Percp-CD3e、1.5 μL PE-CD122、1.5 μL APC-NK1.1 3種熒光標(biāo)記抗體，4℃避光反應(yīng)30 min，4℃、1 500 r/min離心5 min，1 mL重懸，避光轉(zhuǎn)入流式管，流式細(xì)胞術(shù)分析，收集50 000個(gè)細(xì)胞，F(xiàn)lowJo 7.6.1軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型鑒定 ROSA26R-YFP(+/+)與Vav-Cre雜交后代小鼠共有17只，鼠尾提取基因組DNA，進(jìn)行基因型分型。已知YFP野生型（wild type，WT）PCR條帶600 bp（YFP-），Cre酶介導(dǎo)表達(dá)YFP的PCR條帶320 bp（YFP+），Cre基因PCR條帶205 bp，基因型分型結(jié)果見圖1。1～17雜交后代小鼠均為YFP(+/-)，1～10、13表達(dá)Cre，見圖2。1～10、13小鼠為雙陽性基因型小鼠ROSA26R-YFP(+/-)Vav-Cre。

Fig.1 The YFP genotyping results of the hydrid mice ROSA26RYFP(+/+)and Vav-Cre圖1 ROSA26R-YFP(+/+)與Vav-Cre雜交后代小鼠YFP基因型鑒定結(jié)果

Fig.2 The Cre genotyping results of the hybrid mice ROSA26R-YFP (+/+)and Vav-Cre圖2 ROSA26R-YFP(+/+)與Vav-Cre雜交后代小鼠Cre基因型鑒定結(jié)果

2.2 各器官YFP表達(dá) 流式細(xì)胞儀檢測ROSA26R-YFP(+/-)Vav-Cre（雙陽性）和C57BL/6小鼠免疫器官（淋巴結(jié)、脾、胸腺和骨髓）和非免疫器官（腎）細(xì)胞的YFP表達(dá)，見圖3。雙陽性鼠淋巴結(jié)、脾、胸腺和骨髓YFP陽性細(xì)胞百分比（n=10，％）分別為 73.87±1.51、56.07±1.47、86.17±1.74、53.60± 3.56；陰性對照C57BL/6小鼠相應(yīng)器官YFP陽性百分比（n=10，％）分別為0.27±0.01、1.33±0.91、0.11± 0.01、0.29±0.03，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為84.17、64.17、85.72、25.97，均P＜0.01）。2種類型小鼠腎中均無明顯YFP表達(dá)，其YFP陽性細(xì)胞百分比（n=10，％）分別為0.72±0.43、0.92±0.27，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.24，P＞0.05）。Vav-Cre介導(dǎo)YFP表達(dá)在免疫器官的造血細(xì)胞中具有特異性。

Fig.3 The expression levels of YFP in immune organs and non immune organs圖3 免疫器官（淋巴結(jié)、脾、胸腺、骨髓）和非免疫器官（腎）YFP表達(dá)情況

Fig.4 The percentages of YFP in the NK cells in lympn nodes,spleen and bone marrow圖4 淋巴結(jié)、脾、骨髓中YFP標(biāo)記NK細(xì)胞的百分比情況

2.3 YFP標(biāo)記NK細(xì)胞的效率 見圖4。流式細(xì)胞儀檢測ROSA26R-YFP(+/-)Vav-Cre和C57BL/6小鼠YFP標(biāo)記NK細(xì)胞的百分比。雙陽性鼠淋巴結(jié)、脾、骨髓中YFP標(biāo)記NK細(xì)胞百分比（n=10，％）分別為76.94±0.84、81.66±1.18、88.92±0.77，陰性對照鼠相應(yīng)YFP標(biāo)記NK細(xì)胞百分比（n=10，％）分別為1.84±1.27、3.7±1.5、1.59±0.85，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為101.61、84.83、159.23，均P＜0.01），免疫器官中Vav-Cre介導(dǎo)的YFP報(bào)告基因系統(tǒng)可以高效標(biāo)記小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞。

3 討論

NK細(xì)胞是人體重要的免疫細(xì)胞，分布于外周各淋巴器官及血液循環(huán)系統(tǒng)，其不需要特異性抗體或抗原預(yù)先致敏而立即發(fā)揮非特異性靶細(xì)胞殺傷作用[4]，尤其是可以迅速殺傷及溶解多種腫瘤細(xì)胞[5-6]。但是目前對NK細(xì)胞的發(fā)育分化機(jī)制及其功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不完全清楚。利用基因敲除小鼠研究NK細(xì)胞發(fā)育是非常有效的手段。

Vav-Cre轉(zhuǎn)基因鼠經(jīng)常被用來介導(dǎo)造血系統(tǒng)中細(xì)胞內(nèi)特定基因的敲除。Vav是血液系統(tǒng)細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子，能在血細(xì)胞、血管上皮等細(xì)胞中特異性活化[7]；而Cre重組酶介導(dǎo)的基因敲除效率仍需要通過基因型鑒定、熒光定量PCR和Western等手段在DNA、mRNA和蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證，不利于研究活體內(nèi)數(shù)量少的細(xì)胞如NK細(xì)胞。本研究引入ROSA26R-YFP熒光報(bào)告基因小鼠與Vav-Cre轉(zhuǎn)基因鼠雜交，借助Cre重組酶去除ROSA26R-YFP報(bào)告基因前的終止密碼子從而表達(dá)YFP[8]，形成有效檢測Cre組織表達(dá)特異性及NK標(biāo)記效率的報(bào)告基因系統(tǒng)。

本研究在篩選出ROSA26R-YFP與Vav-Cre小鼠雜交后代中雙陽性基因型小鼠的基礎(chǔ)上，流式分析并檢測ROSA26R-YFP(+/-)Vav-Cre小鼠免疫器官（淋巴結(jié)、脾、骨髓、胸腺）中YFP表達(dá)，通過YFP表達(dá)量證實(shí)了在免疫器官的造血細(xì)胞中Vav-Cre介導(dǎo)的YFP報(bào)告基因系統(tǒng)的特異性。利用造血系統(tǒng)中Vav-Cre介導(dǎo)的YFP報(bào)告基因系統(tǒng)有效性的平臺，YFP標(biāo)記NK細(xì)胞的百分比均達(dá)75％以上。有研究報(bào)道，ROSA26R-YFP（+/+）Vav-Cre小鼠富集骨髓中的造血干細(xì)胞，陽性率可達(dá)100％，富集胎肝中造血干細(xì)胞，陽性率可達(dá)94.1％[9]，這與本研究結(jié)果有所差異，分析原因可能與后者的YFP基因純合有關(guān)。由于本研究使用的是YFP雜合子小鼠即ROSA26R-YFP(+/-)Vav-Cre，有可能造成細(xì)胞在不斷增殖過程中基因丟失，從而使表達(dá)量減少。盡管本研究中YFP標(biāo)記NK細(xì)胞效率并沒有達(dá)到100％，但是其結(jié)果仍具有高效性和特異性，為了更加高效標(biāo)記NK細(xì)胞，今后可以使用ROSA26R-YFP小鼠繼續(xù)回交來獲得YFP純合的小鼠。

總之，本研究構(gòu)建了一種特異性YFP報(bào)告系統(tǒng)，利用YFP對NK細(xì)胞發(fā)育進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，有利于客觀地精確分析NK細(xì)胞的增殖，分裂和殺傷功能，對深入探討NK細(xì)胞的發(fā)育和功能具有重要意義，也為以NK細(xì)胞為治療靶點(diǎn)藥物研發(fā)提供了有力工具。

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（2013-12-04收稿 2014-04-25修回）

（本文編輯 李國琪）

The Specificity and Efficiency of YFP Labeled NK Cells through Vav-Cre Induced YFP Reporter System in Mice

LI Dandan1,MENG Xinyi2,LEI Lei2,YIN Jie2,WANG Xi2,ZHANG Ling1△
1 Department of Physiology,2 Department of Cell Biology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China△

E-mail：zhanglsl@tijmu.edu.cn

ObjectiveTo explore the specificity and efficiency of YFP labeled natural killer(NK)cells through Vav-Cre induced YFP reporter system in mice.MethodsROSA26R-YFP and Vav-Cre mice were crossed,and their YFP and Cre gene double positive progeny were screened by genotyping.The specificity of YFP in hematopoietic cells from immune organs including lymph nodes,spleen,thymus and bone marrow were analyzed by flow cytometry.The percentages of YFP positive cells in NK cells from lymph nodes,spleen and bone marrow were also analyzed by flow cytometry.ResultsA total of 11 double positive mice(ROSA26R-YFP-(+/-)VavCre)were obtained in 17 mouse offspring by crossing ROSA26RYFP mice with Vav-Cre mice.The percentages of YFP positive cells in immune organs including lymph nodes,spleen,thymus and bone marrow were 73.87％±1.51％,56.07％±1.47％,86.17％±1.74％and 53.60％±3.56％,and there were significant differences compared with the corresponding negative control cells（0.27％±0.01％,1.33％±0.91％,0.11％±0.01％and 0.29％±0.03％,P＜0.01).There were no YFP expressions in non-immune organs in double positive mice and in negative control mice(0.72％±0.43％vs 0.92％±0.27％,P＞0.05).The positive rates of YFP were significantly higher in NK cells in lymph nodes,spleen and bone marrow(76.94％±0.84％、81.66％±1.18％and 88.92％±0.77％)compared with those of control (P＜0.01).ConclusionYFP marked NK cells through Vav-Cre induced YFP reporter system in mice have high specificity and efficiency.

killer cells,natural;immune system;genes,reporter;mice,transgenic;hybridization,genetic;yellow fluorescent protein;Cre recombinase

R392

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.007

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81171899）

1天津醫(yī)科大學(xué)生理教研室（郵編300070）,2細(xì)胞生物學(xué)系

△通訊作者 E-mail：zhanglsl@tijmu.edu.cn