苧麻木質(zhì)素合成酶CAD基因的cDNA克隆及表達分析

朱偉溢，陳建榮，彭彥，張學(xué)文，郭清泉，趙燕*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.長沙學(xué)院生物工程與環(huán)境科學(xué)系，湖南 長沙 410003)

苧麻木質(zhì)素合成酶CAD基因的cDNA克隆及表達分析

朱偉溢1，陳建榮2，彭彥1，張學(xué)文1，郭清泉2，趙燕1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.長沙學(xué)院生物工程與環(huán)境科學(xué)系，湖南 長沙 410003)

采用PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆苧麻栽培種湘苧3號CAD基因全長cDNA序列；再運用qRT–PCR技術(shù)對木質(zhì)素含量不同的代表性苧麻品種湘苧1號、湘苧3號、湘潭大葉白和城步青麻的CAD基因在其莖稈韌皮部和木質(zhì)部的表達進行定量分析；使用1%間苯三酚和25%鹽酸對4種苧麻莖橫切片進行特異染色，觀察品種間木質(zhì)素染色度。結(jié)果表明，獲得的苧麻CAD基因cDNA序列全長為1 378 bp(GenBank 登錄號，KF758396)，編碼359個氨基酸，推導(dǎo)為苧麻肉桂醇脫氫酶(BnCAD)。該推導(dǎo)蛋白質(zhì)與已報道的幾種植物木質(zhì)素合成酶CAD的同源性均達90%以上，其中與蒺藜苜蓿的同源性達97%。運用qRT–PCR方法對BnCAD基因表達的定量分析結(jié)果顯示，苧麻CAD基因在湘苧1號和湘苧3號的韌皮部表達水平明顯高于其在木質(zhì)部的表達水平，而在城步青麻木質(zhì)部的表達水平高于其在韌皮部的表達水平，該基因在湘潭大葉白的韌皮部和木質(zhì)部表達量接近。4種苧麻莖橫切片的木質(zhì)素染色結(jié)果表明，品種間木質(zhì)素染色度與CAD基因在其韌皮部的表達量成正相關(guān)。

苧麻；木質(zhì)素合成酶CAD基因；克??；表達分析

苧麻(Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.)屬蕁麻科苧麻屬草本植物，其纖維是重要的紡織原料，近年來木質(zhì)纖維被用于生物燃料乙醇發(fā)酵[1]，是具有較大經(jīng)濟利用價值的纖維植物。低木質(zhì)素的木質(zhì)纖維更有利于苧麻作為紡織原料、水土保持植物以及生物燃料等，而研究其木質(zhì)素合成、組成和代謝的分子生物學(xué)規(guī)律，可以指導(dǎo)低木質(zhì)素含量苧麻的選育和對其代謝調(diào)控的人工干預(yù)。通過對模式植物擬南芥的研究，木質(zhì)素合成的代謝具體途徑已有了較清晰的認識[2]，其以苯丙酸為起始，經(jīng)過一系列生化反應(yīng)生成木質(zhì)素化學(xué)單體，單體進一步氧化聚合生成相應(yīng)的木質(zhì)素。這些木質(zhì)素通過多種鍵型連接在一起，隨機形成復(fù)雜的木質(zhì)素聚合體，隨后該大分子聚合體在植物體內(nèi)執(zhí)行相應(yīng)的生物學(xué)功能[3]。

肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)是木質(zhì)素生物合成途徑的最后一個關(guān)鍵酶，分離苧麻肉桂醇脫氫酶(BnCAD)是研究木質(zhì)素生物合成及代謝途徑的基礎(chǔ)。利用基因工程技術(shù)，降低煙草[4]、擬南芥[5]、黑麥草[6]CAD基因的表達量，能夠獲得木質(zhì)素含量降低或者單體組分改變的植株。

苧麻木質(zhì)素生物合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶CCoAOMT、COMT基因已有報道，陳建榮等[7–8]克隆了CCoAOMT 基因cDNA全長序列，并利用苧麻CCoAOMT基因進行表達干擾導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株生長勢有不同程度的減弱。但關(guān)于苧麻中 CAD基因的研究尚未見報道。本研究以苧麻栽培種湘苧3號為材料，擬通過對其轉(zhuǎn)錄組測序信息分析，設(shè)計引物，采用PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆其CAD基因全長cDNA分子。對湘苧1號，湘苧3號，湘潭大葉白，城步青麻等4個具有代表性的[9]苧麻品種的CAD基因在韌皮部和木質(zhì)部的表達進行分析，同時對4種苧麻莖切片進行染色，以進一步分析木質(zhì)素與CAD基因表達量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試苧麻

供試苧麻品種為苧麻(Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.)栽培種湘苧1號、湘苧3號以及野生種湘潭大葉白、城步青麻，均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻資源圃提供。

1.1.2 菌 株

大腸桿菌DH5α由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細胞生物學(xué)實驗室提供。

1.2 方 法

1.2.1 苧麻木質(zhì)素合成酶CAD基因cDNA核心序列的擴增

將苧麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未公開)與已發(fā)表的其他植物CAD基因的cDNA進行比對，針對同源性高的核心保守區(qū)序列，運用 DNAman軟件設(shè)計引物CAD–up(5′–CAGGGAAGTTGGGATTGACGATG–3′)，CAD–dn(5′–CGTTAGCGGAACAGAAGTCTAG CAT–3′)，以擴增CAD基因的cDNA核心序列。

取成熟期的湘苧3號莖稈，用SV Total RNA試劑盒(Promega公司)提取總 RNA，用 Prime-ScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)

Ⅱ

進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA作為核心序列擴增的模板。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 模板 1 μL、dNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL、10× Buffer 2.5 μL、CAD-up引物1 μL、CAD-dn引物 1 μL、TaqDNA聚合酶(2.5U/μL) 0.5 μL、ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s、56 ℃ 退火40 s、72 ℃延伸1 min，25個循環(huán)；72 ℃終末延伸 10 min。PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)回收后，連接至pMD18–T載體(TaKaRa)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，通過 Amp抗性篩選和X–gal/IPTG 藍白斑篩選，挑取白色陽性克隆進行菌落PCR檢測(檢測所用引物是CAD–up和CAD–dn)和酶切檢測(酶切所使用的酶是Pst I、Eco RI，均購自 Fermantas)。將檢測的陽性單菌落搖菌并提取質(zhì)粒送上海鉑尚生物技術(shù)公司測序。

1.2.2 苧麻木質(zhì)素合成酶CAD基因cDNA末端序列的擴增

以獲得的 CAD基因核心序列為模板，設(shè)計5′RACE巢式PCR引物CAD 5′–GSP1(5′–ATGGTTG AAGGTGTAAACGG–3′)、CAD 5′–GSP2(5′–CTGCA AGAGTTGACGTAAGTTC–3′)及3′RACE巢式PCR引物CAD 3′–GSP1(5′–CCTACGTGTCCCTGTTGA AGAC–3′)、CAD 3′–GSP2(5′–TGCTAGACTTCTGT TCCGCTAAC–3′)。用5′–Full RACE Kit with TAP (TaKaRa)和3′–Full RACE Core Set with PrimeScript?(TaKaRa)分別進行3′端和5′端的RACE反應(yīng)。

將上述 RACE產(chǎn)物回收、純化，分別連接pMD18–T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過Amp抗性篩選和 X–gal/IPTG 藍白斑篩選，挑取白色陽性克隆進行菌落PCR檢測(檢測引物為5′RACE、3′RACE巢式PCR引物)和酶切檢測(用Pst I、Eco RI進行雙酶切檢測)，將檢測為陽性的單菌落搖菌并提取質(zhì)粒送上海鉑尚生物技術(shù)公司測序。

1.2.3 苧麻木質(zhì)素合成酶CAD基因拼接序列分析

利用DNAman軟件進行序列比對、拼接，用序列處理在線工具包(SMS)進行ORF查找、翻譯。在NCBI上進行BLAST和蛋白質(zhì)序列的CDD搜索。利用MEGA5.1軟件構(gòu)建CAD蛋白分子系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 苧麻木質(zhì)素合成酶CAD基因在不同品種的苧麻中的表達

取田間栽種的成熟期苧麻莖桿中部為材料，按以上方法分別提取湘苧1號、湘苧3號、湘潭大葉白、城步青麻4個苧麻品種莖桿的韌皮部和木質(zhì)部組織的總RNA和cDNA。以苧麻高度保守的內(nèi)源肌動蛋白Actin1為內(nèi)參基因，BnCAD為目的基因同時進行熒光定量PCR反應(yīng)。用于BnCAD 基因擴增的引物為Up(5′–GGCATGAGATTGTTGGAATTG–3′)和Dn(5′– CATGGTTGAAGGTGTAAACGG–3′)。用于苧麻Actin1擴增的引物為Actin1–up(5′–CTCGTCT GCGACAATGGTAC–3′)和Actin1–dn (5′–GACAAT ACCGTGTTCAATGGG–3′)。利用LightCycler 480 System進行熒光定量 PCR反應(yīng)，具體步驟參照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行。

1.2.5 苧麻莖稈切片及顯微觀察

于8:00–9:00分別取湘苧1號、湘苧3號、湘潭大葉白、城步青麻4種苧麻莖稈的上、中、下部，利用leitz1400型滑走切片機切片，用1%間苯三酚和25%鹽酸染色后置于BX51型OLYMPUS研究顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 苧麻CAD基因的克隆

PCR檢測結(jié)果表明，從湘苧3號莖稈擴增出953 bp的核心片段(圖1)，與預(yù)期目的片段長度相符。根據(jù)核心序列使用3′和5′RACE法，擴增到400 bp的3′端片段(圖2)和500 bp的5′端片段(圖3)，均與預(yù)期目的片段的長度相符。

圖1 BnCAD中間片段擴增結(jié)果Fig.1 PCR results for intermediate fragment of BnCAD

圖2 BnCAD基因3′ RACE擴增結(jié)果Fig.2 Results of BnCAD 3′ RACE amplification

圖3 BnCAD基因5′ RACE擴增結(jié)果Fig.3 Results of BnCAD 5′ RACE amplification

2.2 苧麻CAD基因拼接結(jié)果

用DNAman軟件將核心片段和3′端及5′端序列進行拼接，得到長1 378 bp的cDNA序列，其中5′端非翻譯區(qū)長134 bp、開放閱讀框(ORF)長 1 077 bp、3′端非翻譯區(qū)長167 bp。NCBI比對結(jié)果顯示，本試驗成功克隆了 BnCAD基因序列，并命名為BnCAD1。將該基因登錄到 GenBank，登錄號為KF758396。

與GenBank已報道的擬南芥、毛白楊、蒺藜苜蓿等多種植物的CAD1蛋白序列進行系統(tǒng)進化關(guān)系分析，結(jié)果(圖4)顯示，苧麻肉桂醇脫氫酶CAD與其他植物的CAD1蛋白差異不大，進一步說明該蛋白質(zhì)屬于 CAD1蛋白家族。相對于單子葉植物，BnCAD1與來源于雙子葉植物的CAD蛋白家族成員親緣關(guān)系更近，其中與蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的親緣關(guān)系最近，同源性達97%。

圖4 植物中CAD蛋白質(zhì)氨基酸序列的進化分析結(jié)果Fig.4 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of CAD proteins from plants

2.3 苧麻CAD基因在4種代表性苧麻品種中的表達

圖5 CAD基因在4種苧麻韌皮部和木質(zhì)部中表達的熒光定量RT–PCR分析結(jié)果Fig.5 The fluorescence quantitative RT–PCR analysis of the expression of CAD in the phloem and xylem in the 4 ramie cultivars

選擇苧麻Actin1為內(nèi)參基因，從生長中期的苧麻中提取莖木質(zhì)部和韌皮部總 RNA，進行qRT–PCR。結(jié)果(圖5)顯示，在4種苧麻的木質(zhì)部中CAD基因在湘苧1號和湘苧3號的表達量略高于城步青麻和湘潭大葉白，而在韌皮部中湘苧1號的表達量最高，其次是湘苧1號，在城步青麻中的表達量最低，而且湘苧1號、湘苧3號、湘潭大葉白這3種苧麻韌皮部CAD基因的表達量比木質(zhì)部CAD基因的表達量要高。

2.4 4種代表性苧麻品種莖橫切面的染色觀察

染色觀察結(jié)果顯示，莖上部的莖橫切面染色(圖6)結(jié)果區(qū)別不大，這是由于木質(zhì)部還處于發(fā)育早期，木質(zhì)素含量均較低，其著色較淺。莖中部橫切面染色(圖7)差別較大，其中湘苧1號染色最深，其次是湘苧3號、湘潭大葉白，而城步青麻的染色最淺。而莖下部由于木質(zhì)素在木質(zhì)部形成沉積，4個苧麻品種的莖橫切面染色(圖8)均較深且無明顯差異。

圖6 4種代表性苧麻莖上部的木質(zhì)部染色Fig. 6 The stain of lignin in top stem of the 4 ramie cultivars

圖7 4種代表性苧麻莖中部的木質(zhì)部染色效果Fig. 7 The stain of lignin in middle stem of the 4 ramie cultivars

圖8 4種代表性苧麻莖下部的木質(zhì)部染色Fig. 8 The stain of lignin in bottem stem in the 4 ramie cultivars

3 討 論

苧麻木質(zhì)素主要由紫丁香基木質(zhì)素(syringyl lignin，S–木質(zhì)素)和愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(guaiacyl lignin，G–木質(zhì)素)2種化學(xué)單體聚合而成。目前已經(jīng)從多種植物中克隆CAD基因，并且通過轉(zhuǎn)基因方法對該基因進行功能研究[10–14]。Halpin等[10]報道，在抑制CAD表達的轉(zhuǎn)基因煙草中，醛醇比的變化大于S/G值，表明CAD 活性降低，抑制松柏醛還原成松柏醇的強度變大，因此，推測CAD 存在不同的CAD 同工酶。反義抑制CAD基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株中，木質(zhì)素含量無明顯變化，但其單體組成以及結(jié)構(gòu)都發(fā)生較大改變，使工業(yè)酸堿提取木質(zhì)素和木質(zhì)素作為飼料被消化更容易[4]。Pliate等[15]通過反義抑制楊樹 CAD活性，得到與轉(zhuǎn)基因煙草類似結(jié)果，即醛醇比的變化大于S/G。除了單基因轉(zhuǎn)化試驗，Chabannes等[16]對煙草CCR、CAD進行雙抑制，得到的轉(zhuǎn)基因煙草不僅木質(zhì)素含量大幅度降低，而且其植株表型和木質(zhì)素性質(zhì)結(jié)構(gòu)更接近野生型。這些研究都證明了在植物木質(zhì)素合成中CAD基因?qū)–木質(zhì)素和G–木質(zhì)素合成所起的關(guān)鍵作用。

在對擬南芥CADs基因的研究[17–19]中，發(fā)現(xiàn)有9個 CADs基因與木質(zhì)素合成相關(guān)，但只有 AtCAD4 和AtCAD5的表達對木質(zhì)素合成起關(guān)鍵性作用[18,20]，而與BnCAD1同源性較高的 AtCAD1在維管束組織中有明顯表達，且在生物代謝途徑中的具體功能還未知[20]。另一個與BnCAD1有較高同源性的基因是毛白楊CAD9(PtCAD9)，該基因經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在毛白楊的葉片和木質(zhì)部表達量均較高[20]，其功能可能是響應(yīng)木質(zhì)素防御途徑[21]。經(jīng)進化分析，與BnCAD1親緣關(guān)系最近的是蒺藜苜蓿(MtCAD1)。Qiao Zhao 等[22]研究發(fā)現(xiàn) MtCAD1基因的缺失能導(dǎo)致細胞壁成分比例發(fā)生改變，說明CAD1基因可能通過影響細胞壁的成分比例來改變韌皮部、木質(zhì)部細胞的結(jié)構(gòu)，從而達到更易降解木質(zhì)素的目的。

根據(jù)前人的研究結(jié)果，結(jié)合本研究對BnCAD1基因在韌皮部、木質(zhì)部的表達分析結(jié)果說明BnCAD1基因主要在韌皮部表達，且在湘苧1號韌皮部的表達量約是在城步青麻韌皮部表達量的 4倍。另外苧麻莖橫切片的木質(zhì)素間苯三酚特異性染色結(jié)果也顯示，BnCAD1基因在韌皮部的表達量與苧麻木質(zhì)部的染色情況呈正相關(guān)?？梢酝茰yBnCAD1基因在苧麻韌皮部表達后促進木質(zhì)素單體的合成，而不同類型的單體經(jīng)一定途徑轉(zhuǎn)移到木質(zhì)部聚集形成木質(zhì)素，間接驗證了 CAD基因在苧麻木質(zhì)素合成過程中的重要性，而 CAD的表達活性高低是否會影響苧麻木質(zhì)素含量或單體成分的變化值得進一步的研究。本研究結(jié)果還顯示BnCAD1在木質(zhì)部的表達量相差不大。同時，筆者發(fā)現(xiàn)4個品種其下部莖稈的木質(zhì)部染色深淺差別不明顯，表明苧麻生長發(fā)育后期CAD基因的表達量差異不大，說明 BnCAD1基因有與擬南芥、毛白楊等類似的CADs基因家族，可能還參與其他代謝過程或者具有其他的未知功能，并在長期進化過程中不同的基因之間存在功能分化，而單獨降低 CAD基因的表達水平對木質(zhì)素含量的影響不大，原因則可能是由于基因家族的冗余作用，從而導(dǎo)致其他相關(guān)代謝產(chǎn)物發(fā)生改變。

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責(zé)任編輯：羅 維

英文編輯：羅 維

cDNA cloning and expression analysis of a lignin synthetase CAD gene in ramie (Boehmeria nivea (L.) Gaud.)

ZHU Wei-yi1, CHEN Jian-rong2, PENG Yan1, ZHANG Xue-wen1, GUO Qing-quan2, ZHAO Yan1*
(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Department of Biotechnology and Environment Science, Changsha University, Changsha 410003, China)

This study is intended to clone CAD from ramie (Boehmeria nivea L. Gaud. cv Xiangzhu 3), and analyze the expression patterns of CAD in stems from 4 representative ramie cultivar. First, the cDNA sequence of CAD were identified by analyzing the transcriptome data of ramie cultivar Xiangzhu 3 and cloned by RT–PCR combined with RACE method. Secondly, the qRT–PCR was carried out to analyze the expression levels of CAD transcripts in 4 ramie cultivars: Xiangzhu 1, Xiangzhu 3, Xiangtaidayebai and Chengbuqingma. Finally, lignin contents among different cultivars were visually analyzed by histochemical staining of transverse sections of ramie stems using the phloroglucin. The BnCAD cDNA sequence was 1 378 bp in length (GenBank accession number, KF758396) and could be translated into a putative protein with 359 amino acids. Blast and protein structure analysis showed that this cDNA sequence is in high homologous with other plant CAD gene, and with 97% homology compared with Medicago truncatula, which confirmed that this cDNA sequence was the CAD gene. qRT–PCR analysis revealed that the expressions of CAD was much higher in phloem than xylem in Xiangzhu 1 and Xiangzhu 3, while Chengbuqingma the opposite, and no obvious difference was observed in Xiangtandayebai. Histochemical lignin assays showed that the staining degree between different cultivars is directly proportional to the quantitative expression of CAD transcripts, suggesting an important role of CAD during ramie lignin synthesis.

ramie; lignin synthase CAD gene; cloning; expression analysis

S563.101

A

1007?1032(2014)05?0481?06

10.13331/j.cnki.jhau.2014.05.006

投稿網(wǎng)址：http://www.hunau.net/qks

2014–03–21

國家自然科學(xué)基金項目(31071457)；湖南省科技計劃項目(2012NK3062)；長沙市科技計劃項目(K1309014–31)

朱偉溢(1989—)，女，湖南常德人，碩士研究生，主要從事分子細胞生物學(xué)研究，258077287@qq.com；*通信作者，zhaoyan 0585@163.com