短梗大參扦插生根特性及相關(guān)生理生化分析

梁文斌，聶東伶，吳思政*，柏文富，沈素貞

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省森林植物園，湖南 長(zhǎng)沙 410116)

短梗大參(Macropanax rosthornii)為五加科大參屬常綠灌木或小喬木，樹形和葉形優(yōu)美，抗寒性和耐蔭性較強(qiáng)，為四川、貴州、湖南、湖北等南方地區(qū)狹域分布的野生觀賞植物，可用于城市園林觀賞和室內(nèi)盆栽。短梗大參野生資源分布有限，蘊(yùn)藏量少，人工繁育是合理開發(fā)利用該野生觀賞植物資源的有效途徑。關(guān)于短梗大參人工繁育方式有種子繁殖和扦插繁殖的研究報(bào)道[1–2]，但未見關(guān)于其生根過程中生理生化變化的報(bào)道。扦插繁殖作為一種簡(jiǎn)便、實(shí)用和經(jīng)濟(jì)的無性繁殖技術(shù)適用于苗木的規(guī)?；a(chǎn)。筆者研究其扦插生根過程中生理生化指標(biāo)的變化，探索其扦插生根的內(nèi)在機(jī)制，旨在為短梗大參的扦插繁殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

生理生化測(cè)定扦插試驗(yàn)用插穗采自湖南省森林植物園短梗大參(Macropanax rosthornii)的3年生硬枝，長(zhǎng)10～15 cm，具 2個(gè)以上腋芽。為方便顯微制片，扦插生根解剖試驗(yàn)用插穗選擇1年生嫩枝。從母樹上隨機(jī)采集健康無病蟲害枝條作為插穗，上端剪成平口，下端剪成約45°的斜切口，將剪好的插穗扎成小捆放在水中保濕待用。

1.2 扦插方法

于2012年4月15日在湖南省森林植物園苗圃扦插床進(jìn)行扦插試驗(yàn)。扦插前1 d 用800 倍多菌靈藥液對(duì)扦插床進(jìn)行消毒。插床基質(zhì)為純黃土。將剪好的3年生硬枝插穗分成2組：處理組(IBA)和對(duì)照組(CK)。通過試驗(yàn)篩選，用500mg/L 的IBA 浸泡處理組插穗基部30min，對(duì)照組插穗基部用清水浸泡。在插床上采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每區(qū)組分別扦插處理組和對(duì)照組的插穗各150 條，每處理重復(fù)3次。將剪好的30 條1年生嫩枝插穗基部用清水浸泡后扦插在插床上的一區(qū)組內(nèi)，扦插深度5～6 cm，扦插后搭小拱棚覆蓋薄膜保濕，再在其上搭建遮陰棚遮陽，進(jìn)行常規(guī)扦插管理。在2012年6月5日統(tǒng)計(jì)生根率、平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)。

1.3 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

3年生硬枝在扦插前(0 d)采樣1次，扦插后每8 d采樣1次，采樣后洗凈吸干，取插穗基部2 cm的皮層測(cè)定生理生化指標(biāo)。多酚氧化酶(PPO)活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[3]中的方法適當(dāng)加以改進(jìn)；過氧化物酶(POD)活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性采用比色方法[4]測(cè)定。

1.4 扦插生根的解剖學(xué)觀察

1年生嫩枝從扦插10 d 后每隔5 d 取樣，直至不定根出現(xiàn)時(shí)為止。每次取5 條插穗，在其基部截取約1.0 cm 的小段，立即投入FAA 固定液中。采用石蠟制片法，切片經(jīng)番紅、固綠染色后用加拿大膠封片，在Motic B5 數(shù)碼顯微鏡下觀察，并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2003 處理數(shù)據(jù)和繪制圖表，用SPSS 13.0 進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)(LSD 法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 短梗大參扦插的生根特性

短梗大參從開始扦插至不定根完全形成約需45 d 時(shí)間。生根分析結(jié)果(表1)表明，IBA 處理的插穗生根率為84.4%，平均不定根條數(shù)為34.74，平均根長(zhǎng)為3.28 cm；對(duì)照插穗生根率為97.0%，平均不定根條數(shù)為20.63，平均根長(zhǎng)為3.66 cm，因此，IBA處理插穗可以提高插穗生根數(shù)量。對(duì)生根過程的觀察結(jié)果表明，插穗切口不形成愈傷組織，而是在離插穗切口約1.5 cm 處產(chǎn)生不定根(圖1–A，B)。從插穗生根解剖來看，不定根原基起源于皮層(圖1–C)，故生根類型為皮部生根型。根據(jù)短梗大參不定根形成特點(diǎn)，大致可劃分為3個(gè)階段，即根的誘導(dǎo)階段( 0～16 d) 、表達(dá)階段( 17～24 d) 和生長(zhǎng)階段(25～45 d)。

表1 短梗大參扦插生根特性 Table 1 Rooting characters of Macropanax rosthornii

圖1 短梗大參的插穗不定根和不定根原基 Fig.1 Adventitious root and their primordium in Macropanax rosthornii cutting

2.2 短梗大參扦插生根過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量

2.2.1 可溶性糖含量

由圖2可見，對(duì)照(CK)和IBA處理插穗40 d生根過程中的可溶性糖含量變化趨勢(shì)基本一致，均為先降后升。在扦插前，CK和和IBA處理插穗的可溶性糖含量分別為6.95、6.68mg/g，在扦插后8 d內(nèi)兩者的可溶性糖含量基本保持穩(wěn)定，在8 d后開始下降。消耗的糖類一方面用于維持插穗的生活力和物質(zhì)轉(zhuǎn)換所需要的能量等；另一方面用于不定根原基的誘導(dǎo)。在24 d時(shí)CK和IBA處理插穗可溶性糖的含量均下降至最低，分別為2.45、3.02mg/g，比扦插前分別下降了64.75%和54.79%。這個(gè)階段正是短梗大 參插穗不定根開始形成的時(shí)期。不定根發(fā)生以后，插穗上的芽開始萌發(fā)形成枝葉，插穗體內(nèi)因自身合成糖類，可溶性糖含量又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中IBA處理后的插穗可溶性糖含量高于CK。扦插后40 d根生長(zhǎng)量增加，根的吸收能力增強(qiáng)，CK和IBA處理的插穗可溶性糖含量分別上升至5.97、8.38mg/g。

圖2 扦插生根過程中短梗大參插穗的可溶性糖含量 Fig.2 Content of soluble sugar during cutting rooting within 40 d

2.2.2 可溶性蛋白質(zhì)含量

由圖3可見，對(duì)照(CK)和IBA處理插穗生根過程中的可溶性蛋白質(zhì)含量均呈先降后升的趨勢(shì)變化。CK和IBA處理插穗的可溶性蛋白質(zhì)含量在扦插前分別為4.25、4.45mg/g，在扦插后開始下降，至8 d 時(shí)降至最低值，分別為1.31、2.10mg/g，比扦插前分別下降了69.18%和52.81%。顯然，在扦插后0～8 d蛋白質(zhì)含量下降幅度大，在此階段蛋白質(zhì)分解為氨基酸，為插穗不定根的誘導(dǎo)和形成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。扦插后8 d插穗中可溶性蛋白質(zhì)含量開始上升，伴隨著不定根的發(fā)生，插穗上的芽開始萌發(fā)，并逐漸形成枝葉，葉片內(nèi)合成的蛋白質(zhì)部分轉(zhuǎn)運(yùn)到插穗中，致使插穗內(nèi)的蛋白質(zhì)含量有所增加，為不定根的生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。扦插后32 d，CK和IBA處理插穗的可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高，分別為6.48 、6.92mg/g，比扦插前提高了52.47%和55.51%。扦插后40 d，CK和IBA處理的可溶性蛋白質(zhì)含量仍較高，且均高于扦插前的水平。由圖3還可以看出，IBA處理有利于插穗中蛋白質(zhì)的積累。

圖3 扦插生根過程中短梗大參插穗的可溶性蛋白質(zhì)含量 Fig. 3 Content of soluble protein during cutting rooting within 40 d

2.3 扦插生根過程中短梗大參插穗的相關(guān)酶活性

2.3.1 PPO 活性

從圖4可知，在短梗大參硬枝扦插生根過程中，對(duì)照(CK)和IBA處理的插穗基部皮層的 PPO活性變化趨勢(shì)基本一致。在扦插后8 d，CK和IBA處理的插穗PPO活性均處于較低水平，其平均值分別為4.14、3.83 U/(g·min)，說明催化生成的生根輔助因子“IAA－酚酸復(fù)合物”較少，隨扦插時(shí)間的延長(zhǎng)，PPO活性快速升高，至扦插后16 d達(dá)到峰值，CK處理的為19.60 U/(g·min)，IBA處理的為25.25 U/(g·min)，分別比扦插前增加了372.29%和515.85%，即相應(yīng)的“IAA－酚酸復(fù)合物”大量增加，有利于不定根的誘導(dǎo)。扦插后24 d時(shí)為根的表達(dá)期，此時(shí)細(xì)胞數(shù)量增多，PPO活性下降至最低點(diǎn)。在根的生長(zhǎng)期，PPO活性開始回升，至扦插后40 d，CK和IBA處理分別上升至25.07、28.30 U/(g·min)，比扦插前分別增加了504.10%和590.24%。

圖 4 扦插生根過程中短梗大參插穗的PPO 活性 Fig. 4 Changes of PPO activity during cutting rooting within 40 d

2.3.2 POD 活性

無論是對(duì)照(CK)還是IBA處理的插穗基部皮層的 POD 活性隨插穗生根的不同階段而發(fā)生規(guī)律性變化(圖5)，兩者變化趨勢(shì)基本一致。在插穗不定根的誘導(dǎo)階段，CK和IBA處理插穗的POD活性增加，在扦插后8 d分別達(dá)到最大值1 487.23、1 611.11 U/(g·min)，比扦插前分別提高了47.10%和59.20%，然后急劇大幅度下降，至16 d時(shí)降至最低，分別為146、205 U/(g·min)，比最大值分別下降了90.18%和87.28%。在不定根的表達(dá)階段，POD活性處于較低水平。在不定根的生長(zhǎng)階段，CK和IBA處理的插穗POD活性逐漸上升，至扦插后32 d出現(xiàn)第2個(gè)峰值，其值分別為990、1 100 U/(g·min)，均明顯低于第一個(gè)峰值，然后POD活性開始下降，在扦插后40 d處于較低水平。

圖 5 扦插生根過程中短梗大參插穗的POD 活性 Fig. 5 Changes of POD activity during cutting rooting within 40 d

2.3.3 IAAO 活性

從圖6可以看出，對(duì)照(CK)和IBA處理的插穗基部皮層的IAAO活性在扦插后均逐漸上升，至扦插后24 d達(dá)到最高，分別為589.53、613.45 U/(g·h)，比扦插前分別提高了8.83%和14.84%，此階段插穗中的IAA含量最低，有利于不定根原基的誘導(dǎo)和表達(dá)。之后插穗IAAO活性開始緩慢下降，導(dǎo)致插穗中IAA 含量升高，有利于不定根的生長(zhǎng)。扦插后40 d時(shí)不定根大量發(fā)生，IAAO活性降至扦插前的水平。IBA處理插穗的IAAO活性變化趨勢(shì)與對(duì)照的變化基本一致，兩者差異不明顯，說明IBA處理對(duì)短梗大參插穗生根過程中的IAAO活性影響不明顯。

圖 6 扦插生根過程中短梗大參插穗的IAAO 活性 Fig. 6 Changes of IAAO activity during cutting rooting within 40 d

3 結(jié)論與討論

短梗大參在黃土中的扦插生根率較高，最高可達(dá)97%，IBA處理插穗可以提高其不定根數(shù)量；扦插生根過程中不產(chǎn)生愈傷組織，生根類型為皮部生根型。

糖類在扦插生根過程中為插穗不定根的誘導(dǎo)、形成和生長(zhǎng)提供所需的能量，而蛋白質(zhì)是植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成物質(zhì)，在調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝等方面有重要作用，因此，可溶性糖含量和蛋白質(zhì)含量與插穗生根有一定的相關(guān)性。在生根誘導(dǎo)期插穗可溶性糖含量和可溶性蛋白質(zhì)含量均下降明顯，消耗的糖類和蛋白質(zhì)一方面用于維持插穗的生活力和物質(zhì)轉(zhuǎn)換所需要的能量等，另一方面用于根原基的發(fā)生。在不定根發(fā)生以后，插穗上的芽開始萌發(fā)形成枝葉，根的吸收能力也開始增強(qiáng)，插穗體內(nèi)因自身合成糖類，可溶性糖含量和可溶性蛋白質(zhì)含量則呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。不少研究[5–8]也表明，插穗生根時(shí)需要足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別是要消耗大量碳水化合物和含氮化合物。另外，本研究中發(fā)現(xiàn)IBA處理的插穗在生根過程中可溶性糖含量和蛋白質(zhì)含量均高于對(duì)照，說明IBA處理有利于插穗中可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的積累，這與柚木嫩枝扦插研究中IBA處理插穗的可溶性糖含量顯著增加[9]相符合。

POD、PPO和IAAO的活性與短梗大參扦插生根密切相關(guān)，在插穗不定根的誘導(dǎo)、表達(dá)和生長(zhǎng)的3個(gè)階段中呈現(xiàn)各自的變化特點(diǎn)，表明它們可能通過相互作用來影響生根。POD 作用的某些產(chǎn)物可能是不定根發(fā)生和發(fā)展所必需的輔助因子，能促進(jìn)不定根的形成[10]。在短梗大參扦插生根過程中，POD活性在根誘導(dǎo)早期較高，在根表達(dá)階段較低，在根生長(zhǎng)階段較高，出現(xiàn)2個(gè)POD活性高峰，可能與POD分別參與根的誘導(dǎo)和表達(dá)有關(guān)[11–14]。因?yàn)镻OD能氧化IAA，消除體內(nèi)過多的內(nèi)源IAA，有利于根原基的誘導(dǎo)[15]，所以，可以認(rèn)為本研究中根表達(dá)期POD活性低有利于IAA免受分解，促進(jìn)根原基不定根的形成。也有扦插生根中POD活性僅出現(xiàn)1個(gè)峰的報(bào)道[10]。

扦插切口易受到外界物質(zhì)侵染而在插穗體內(nèi)生成大量自由基，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生傷害，而多酚氧化酶(PPO)活性的增強(qiáng)可以消除自由基對(duì)機(jī)體的影響，同時(shí)，PPO催化酚類物質(zhì)和IAA－酚酸復(fù)合物能促進(jìn)不定根的發(fā)生與發(fā)育[16]。此外，PPO影響細(xì)胞分裂、分化及根原基的形成和生長(zhǎng)，被認(rèn)為參與了“生根素”的合成，從而刺激植物離體材料扦插生根[17]，因此，插穗不定根的發(fā)生與PPO活性的升高密切相關(guān)。在本研究中，PPO在生根誘導(dǎo)期維持較高的活性，有利于插穗生根的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)，這與曹邦華等[18]的研究結(jié)論一致。在根的表達(dá)期PPO活性下降，這可能是因?yàn)樵诖穗A段短梗大參不定根開始大量形成，細(xì)胞數(shù)量增多，PPO參與細(xì)胞分裂、分化。這與閆紹鵬等[19]的研究結(jié)果基本一致。

IAA具有多種生理功能，能促進(jìn)不定根的發(fā)生與發(fā)育，而IAAO可以氧化IAA，因此，IAAO活性的大小與根的發(fā)生有重要關(guān)系[10,15]。試驗(yàn)結(jié)果表明，離體生根過程中高活性的IAAO使內(nèi)源IAA水平降低是生根誘導(dǎo)期的特點(diǎn)之一[20–21]。宋金耀等[11]認(rèn)為, 在生根誘導(dǎo)期高IAAO活性降低了IAA濃度，有利于根的誘導(dǎo)，而在根誘導(dǎo)后期IAAO 活性降低，使IAA免受破壞，以促進(jìn)根的萌發(fā)和生長(zhǎng)。這與本研究中不定根的誘導(dǎo)和表達(dá)期插穗表現(xiàn)出高的IAAO活性，而在不定根的生長(zhǎng)期插穗IAAO活性下降的結(jié)論基本一致。

本研究中IBA處理插穗對(duì)扦插生根中PPO、POD和IAAO活性的影響不明顯，表明這3種酶活性的大小可能只與扦插生根有關(guān)。這與勒棟梁等[17]在雜交榛綠枝扦插試驗(yàn)中的研究結(jié)果有類似之處，但也有關(guān)于IBA處理明顯提高了插穗內(nèi)POD活性和PPO活性，而IAAO活性下降且維持在較低水平的報(bào)道[22]。

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