馬鈴薯Y病毒基因組連接蛋白的原核表達及純化

楊炳輝 高亦兵

（揚州出入境檢驗檢疫局 江蘇揚州 225009）

馬鈴薯Y病毒基因組連接蛋白的原核表達及純化

楊炳輝 高亦兵

（揚州出入境檢驗檢疫局 江蘇揚州 225009）

設(shè)計合成馬鈴薯Y病毒基因組連接蛋白基因的特異引物，以本實驗室獲得的AQ4分離物cDNA為模板，通過PCR方法擴增得到目的基因，連入表達載體PEHISEGFPTEV 及 PEHISTEV，用IPTG誘導(dǎo)，使其在大腸桿菌中得到正確表達，并利用鎳柱對VPg蛋白進行純化，為抗血清的制備以及VPg蛋白晶體結(jié)構(gòu)和互作蛋白的研究奠定基礎(chǔ)。

馬鈴薯Y病毒；基因組連接蛋白基因；原核表達；蛋白純化

1 前言

馬鈴薯Y病毒（Potato Virus Y，PVY）寄主非常廣，主要危害馬鈴薯、煙草、番茄、辣椒和茄子等茄科作物，分布于所有的馬鈴薯種植區(qū)[1]。我國由北向南馬鈴薯的PVY帶毒率依次增高，造成我國中部和南部地區(qū)不能自行留種，必須從東北、內(nèi)蒙古等發(fā)病輕的地區(qū)調(diào)種，給生產(chǎn)造成了巨大損失[2]。因寄主品種和病毒株系不同，PVY可使馬鈴薯發(fā)生不同程度的癥狀，如壞死、枯斑及小葉黃化等，導(dǎo)致馬鈴薯退化，產(chǎn)量降低，損失高達80％[3]。當(dāng)與其他病毒混合感染時，會產(chǎn)生粗縮花葉，損失更是十分嚴重[4]，因此，PVY與馬鈴薯卷葉病毒一樣被認為是感染馬鈴薯的病毒中傳播最為廣泛，造成經(jīng)濟損失最為嚴重的病毒之一[5]。

PVY屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae），馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）[6]，病毒粒呈彎曲線狀[7]，含有約10 Kb的單鏈正義RNA基因組；基因組5’末端有共價結(jié)合基因組連接蛋白（Virus genome-linked protein，VPg），3’端含有Poly （A）尾巴[8]；基因組中開放閱讀框的兩端含有非翻譯區(qū)（UTR），只包含一個開放閱讀框架（ORF），進行表達時先翻譯成一個大的多聚蛋白，再通過自身編碼的蛋白酶將多聚蛋白加工成小的、有功能的蛋白[9]。

VPg由NIa-Pro蛋白酶從NIa的N端水解下來，它的功能較多，可以通過與RNA聚合酶互作而作為病毒RNA復(fù)制酶的引物參與病毒復(fù)制[10]，也可參與病毒的細胞間運動和長距離系統(tǒng)侵染[11-12]，因此在病毒侵染循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[13-14]。闡明VPg蛋白的功能，對揭示病毒整個生命過程的細胞生物學(xué)機制有著重要的促進作用，也可為抗病毒工程提供參考[15]。但由于受制于整個病毒細胞生物學(xué)的研究，目前對于VPg的研究還不夠完全，它的許多功能仍未知曉。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

PVY AQ分離物：由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒實驗室分離并保存；大腸桿菌菌株DH5α、大腸桿菌Rossata：均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒實驗室提供；原核表達載體pEHISEGFPTEV和pEHISETEV：由英國圣安德魯斯大學(xué)劉煥庭教授饋贈；T4 DNA連接酶、dNTP、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000、無RNase的水、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等：購自TaKaRa公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 plus：購自北京全式金公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒：購自北京博大泰克公司；其他生化試劑及普通化學(xué)試劑：均為進口或國產(chǎn)分析純；本研究所有引物：均由北京博尚生物公司合成。

2.1.2 儀器

高速離心機：Himac CR 22GⅡ；小型臺式離心機：Eppendorf 5417R；-80℃超低溫冰箱：SANYO MDF-382E；電子天平：METTLER TOLEDO AL104；蛋白質(zhì)核酸測定儀：Ultra-Spec 2100；超微量分光光度計：Analytikjena Scandrop；PCR擴增儀：BioRad-MyCycler；凝膠成像系統(tǒng)：BIO-BEST 140E；制冰機：SIM IF300-500；超凈工作臺：AIRTECH SW-CJ-2FD；電泳儀：DYY-6C；水浴鍋：SPC-6；高低溫振蕩培養(yǎng)箱：HZQ-F160A；pH計：PHS-3E；微量移液器：Eppendorf Research plus；磁力攪拌器：78-1；數(shù)碼照相機：Canon G12。

2.2 方法

2.2.1 PVY VPg基因的克隆

本研究以PVY AQ分離物cDNA為模板，以VPg-F（CATGCCATGGGGAAAAATAAATCCAA AAGAATCC）和VPg-R（AAATGCGGCCGCTTA TTCATGCTCCACCTCCTG）為引物，擴增所需目的片段；引物兩端分別引入Nco I和Not I酶切位點；PCR產(chǎn)物經(jīng)1％低熔點瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段；回收程序參照北京博大泰克公司B型小量DNA片段快速膠回收試劑盒說明；回收產(chǎn)物與表達載體PEHISEGFPTEV及PEHISTEV用Nco I和Not I進行雙酶切后經(jīng)DNA連接酶連接，在4℃冰箱中連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossata菌株。

2.2.2 目的基因的表達

從轉(zhuǎn)化Rossata的LB板上挑取單菌活化后的菌液1：100稀釋到10 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，227 rpm培養(yǎng)至OD600達到0.4-1；加IPTG至終濃度0.2 mmol/L，繼續(xù)于37℃培養(yǎng)；在180 rpm搖培速度和相同IPTG濃度、相同時間下，設(shè)溫度梯度（25℃，37℃）；在180 rpm搖培速度和相同IPTG濃度、相同溫度下，設(shè)時間梯度（2 h、4 h、6 h、8 h）；在180 rpm搖培速度和相同溫度、相同時間下，設(shè)IPTG濃度的梯度（0.2 mmol/L、0.6 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/ L）；離心收集菌體，加適量TE溶液（pH 8.0），振蕩懸浮，再加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，SDS-PAGE電泳檢測表達情況。

2.2.3 PVY AQ分離物融合蛋白的純化

在冰上用10 mL樣品緩沖液（1×PBS，含0.3 mol/L NaCl、10 mmol/L咪唑）重懸所得菌體，進行超聲波破碎；4℃，12 000 rpm離心30 min；所得上清液用0.2 μm的過濾器過濾后，裝到已用樣品緩沖液平衡的Ni-NTA柱上，樣品流速維持在1 mL/min；用3×（床）體積的漂洗緩沖液（1×PBS，含0.3 mol/L NaCl、30 mmol/L咪唑、1 mmol/L PMSF）洗滌，然后用洗脫緩沖液（1×PBS，含0.3 mol/L NaCl、250 mmol/L咪唑、1 mmol/L PMSF）洗脫；每次過柱皆要收集部分過柱后液體留樣，洗脫產(chǎn)物全部收集；SDSPAGE分析含有蛋白的組分，并收集靶標(biāo)蛋白；用含0.3 mol/L NaCl、1 mmol/L DTT、25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）的PBS對純化的靶標(biāo)蛋白透析2 h，中間更換1次透析緩沖液；收集純化的蛋白以備TEV蛋白酶酶解或加入20％甘油，-70℃保存。

3 結(jié)果與分析

3.1 PVY VPg基因的克隆及表達載體的構(gòu)建

本研究用PCR方法擴增了PVY AQ4分離物的VPg基因（圖1），擴增片段長度約600 bp與預(yù)期結(jié)果（564 bp）一致。

將克隆的V P g基因連接到原核表達載體PEHISEGFPTEV以及PEHISTEV上，熱激法轉(zhuǎn)化Rossata，10-12 h后可看到白色菌落。挑取單菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，進行PCR擴增和酶切鑒定，酶切后電泳檢測，切下的片段所處位置與PCR擴增產(chǎn)物的位置相近（圖2），含有目的片段的菌液可供誘導(dǎo)表達用。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物

圖2 重組質(zhì)粒VPg的酶切鑒定

3.2 目的基因的原核表達與SDS-PAGE分析

將經(jīng)PCR擴增和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossata，挑取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中（含卡那霉素50 μg/mL），37℃活化過夜；1：100稀釋到10 mL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 rpm，3 h，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，繼續(xù)于25℃培養(yǎng)3 h；取菌液進行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明在47 KD左右出現(xiàn)一條特異性蛋白帶，符合預(yù)期表達融合蛋白的大小，說明外源蛋白已在大腸桿菌細胞中表達。

3.3 融合蛋白誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化分析

根據(jù)所設(shè)時間梯度，時間越長，表達量越大，但6 h與8 h基本一致，增加的幅度較??；在不同濃度IPTG的誘導(dǎo)下，融合蛋白均能有效表達，且影響不大；根據(jù)菌液顏色判斷，25℃優(yōu)于37℃。試驗結(jié)果詳見圖3、圖4。根據(jù)上述研究結(jié)果確定融合蛋白在大腸桿菌Rossata菌株中誘導(dǎo)表達的最佳IPTG濃度0.2 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為25℃，誘導(dǎo)時間為6 h。

圖3 37℃下融合蛋白在大腸桿菌中的表達

圖4 25℃下融合蛋白在大腸桿菌中的表達

3.4 PVY VPg蛋白的純化

將超聲波破碎后含有目的蛋白的上清液裝到已用樣品緩沖液平衡的Ni-NTA柱上進行純化，先用3×（床）體積的漂洗緩沖液漂洗雜蛋白，然后用洗脫緩沖液對目的蛋白進行洗脫，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示獲得了比較純的目的蛋白（圖5），洗脫的目的蛋白肉眼可見明亮的綠色熒光（圖6）。

圖5 融合蛋白的SDS-PAGE

圖6 純化后融合蛋白的熒光

4 討論

本研究利用表達載體pEHISEGPPTEV和PEHISTEV，在大腸桿菌Rossata菌株中成功表達了PVY 的VPg基因。VPg基因與GPF基因融合，菌液呈現(xiàn)強烈的綠色熒光。eGFP堅固的桶狀結(jié)構(gòu)能夠很好的保護六肽生色團，而生色團只有在完整的蛋白中才會發(fā)出強烈的熒光。如果蛋白翻譯不完整或者結(jié)構(gòu)受到破壞，其熒光特性將會改變。因為目的蛋白與eGFP是融合表達且與eGFP具有相同的熒光特性，因此融合蛋白的熒光強弱與其表達量的多少成正比。根據(jù)綠色熒光的強弱，可以判斷靶標(biāo)蛋白的表達量。蘭玉菲等用此方法成功表達了煙草脈帶花葉病毒的cp基因[16]。

本實驗構(gòu)建了PVY VPg基因的原核表達載體，使其在大腸桿菌中得到了正確表達，并在表達條件的選擇上進行了優(yōu)化，誘導(dǎo)菌液的濃度、誘導(dǎo)時間、IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度等對蛋白的表達均有影響。對含重組轉(zhuǎn)化子的大腸桿菌Rossata進行誘導(dǎo)時，接種的菌液必須新鮮，否則細菌的生長速度緩慢，在預(yù)定的時間內(nèi)達不到誘導(dǎo)的濃度；加IPTG時，菌的生長濃度對基因是否表達非常重要，菌液濃度太高，表達效果不好，菌液濃度太低，則加IPTG之后細菌生長緩慢，OD600值在 0.4-0.6為最佳；誘導(dǎo)的時間一般為4-6 h，時間延長或過夜，效果反而不好；適宜濃度的IPTG會增加蛋白的可溶性，IPTG濃度過高，易使蛋白表達速度增大，來不及正確折疊而產(chǎn)生不溶性蛋白（包含體），根據(jù)實驗所設(shè)梯度，在一定范圍內(nèi)IPTG濃度對誘導(dǎo)表達量的影響并不大；實驗證明，25℃條件誘導(dǎo)優(yōu)于37℃，因為低溫誘導(dǎo)可使蛋白緩慢合成，有利于蛋白正確折疊形成可溶性蛋白；為了得到更多的可溶性蛋白，可以考慮再降低溫度，但表達總量可能會有所降低，故可以適當(dāng)?shù)难娱L誘導(dǎo)時間；由于實驗室設(shè)備所限，低溫誘導(dǎo)難以保障恒定的低溫條件，增加了低溫誘導(dǎo)的難度。因此，本實驗采取25℃，IPTG濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)6 h獲得大量的靶標(biāo)蛋白，用于后續(xù)純化實驗。

本研究成功的表達和純化了PVY AQ分離物的VPg基因，并利用HIS標(biāo)簽與鎳柱特異性結(jié)合的特性，用鎳柱純化靶標(biāo)蛋白，獲得表現(xiàn)強烈綠色熒光的純化蛋白，為抗血清的制備提供了條件。通過該融合蛋白制作的抗血清可用于轉(zhuǎn)基因煙草的快速檢測，可為檢驗檢疫工作節(jié)省大量寶貴的時間。除此之外，本研究的結(jié)果還為VPg蛋白晶體結(jié)構(gòu)的研究和互作蛋白篩選奠定了基礎(chǔ)。

5 結(jié)論

本研究表達和純化了PVY AQ分離物的VPg基因，并利用HIS標(biāo)簽與鎳柱特異性結(jié)合的特性，用鎳柱純化靶標(biāo)蛋白，獲得表現(xiàn)強烈綠色熒光的純化蛋白，并優(yōu)化了蛋白表達的條件。實驗證明，在25℃時，IPTG濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)6 h可獲得大量的靶標(biāo)蛋白，用于后續(xù)純化實驗。

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Prokaryotic Expression and Purifi cation of Potato Virus Y Virus Genome-Linked Protein

Yang Binghui, Gao Yibing
(Yangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Yangzhou, Jiangsu, 225009)

In this study, the specific primers of virus genome-linked protein (VPg) gene of PVY were designed. And the VPg gene was obtained by PCR with the cDNA of AQ4 isolates as a template. Then the sequence was cloned into expression vectors PEHISEGFPTEV and PCRPEHISTEV. Induced with IPTG, the gene was expressed successfully in Rossata strain of Escherichia coli. We purifi ed VPg by Ni-NTA column, and the purifi ed VPg could be used for it’s antiserum preparation, and for exploration of it’s structure or it’s interacting proteins.

Potato virus Y; VPg Gene; Prokaryotic Expression; Protein Purifi cation

Q939.46