氟喹諾酮類殘留檢測方法的研究進(jìn)展

王晶晶 許常旭 黃華國 陸志波

（1.寧波出入境檢驗檢疫局 浙江寧波 315012；2.中國藥科大學(xué)；3.洞頭縣產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所；4.同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院）

氟喹諾酮類殘留檢測方法的研究進(jìn)展

王晶晶1,4許常旭2黃華國3陸志波4

（1.寧波出入境檢驗檢疫局 浙江寧波 315012；2.中國藥科大學(xué)；3.洞頭縣產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所；4.同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院）

氟喹諾酮類藥物作為廣譜高效抗菌藥物，在國內(nèi)外畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，但其殘留超標(biāo)會危害人體健康, 此問題越來越被人們重視。本文就氟喹諾酮類藥物的特性以及4大類殘留檢測方法進(jìn)行了綜述。

氟喹諾酮類藥物；特性；殘留檢測

1 前言

氟喹諾酮（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）又稱新喹諾酮，是一系列新型6-氟取代的喹諾酮類(Quinolone，QNs)衍生物，具有吸收性好，抗菌譜廣，抗菌作用強，半衰期長，血藥濃度高，化學(xué)合成簡便，價格低廉等優(yōu)點，是人醫(yī)和獸醫(yī)的常用藥。隨著FQs類藥物在畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛應(yīng)用，常伴有濫用藥情況出現(xiàn)，不但提高了致病菌的耐藥性，也增加了某些FQs類藥物的潛在致癌性等風(fēng)險，因此，其殘留問題已引起了人們高度重視。本文綜述了動物性食品中FQs類藥物特性及其殘留檢測方法。

2 FQs類藥物特性

自1979年發(fā)現(xiàn)諾氟沙星(Norfloxacin)以來，F(xiàn)Qs類抗菌藥憑借其優(yōu)異的抗感染作用，得到快速發(fā)展。目前世界上已有15個FQs類藥物上市，還有近50種正在開發(fā)中，其中甲磺酸達(dá)氟沙星、鹽酸二氟沙星、恩諾沙星、鹽酸沙拉沙星為獸類專用藥。

2.1 FQs類藥物的構(gòu)效關(guān)系

FQs類藥物的基本結(jié)構(gòu)通式見圖1，因在喹諾酮萘啶環(huán) 6 位F的引入而得名為氟喹諾酮。F的引入提高了化合物的脂溶性，增強了對組織細(xì)胞的滲透性，因而吸收好，組織濃度高，更顯著增強化合物抗G-致病菌的效力和擴大抗G+菌譜；1 位通常連接一個烴基(如乙基或環(huán)丙基)，可影響抗菌活性和抗菌譜；3位的羧基和4的位羰基為抗菌活性必需，可以與受體酶蛋白形成離子鍵和氫鍵；8位雜環(huán) X 可以是C、N或 O原子，母核上 2、5、7位的修飾可以改變化合物藥動學(xué)特性。

圖1 FQs類藥物的結(jié)構(gòu)通式

2.2 FQs類藥物的作用機制及耐藥機制

FQs類藥物通過選擇性與G-菌DNA雙鏈中非配對堿基結(jié)合，抑制DNA 螺旋酶的A亞單位，使DNA超螺旋結(jié)構(gòu)不能封口，不能形成負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)，同時又可選擇性抑制G+菌拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，從而影響 DNA 的正常形態(tài)與功能，阻礙 DNA的正常復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運與重組，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

近年來，隨著FQs類藥物在臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)的濫用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥率上升，耐藥菌株增多。FQs耐藥菌的來源通常有醫(yī)源性、動物源性、食源性，耐藥機制主要有：①DNA螺旋酶亞基A或拓?fù)洚悩?gòu)酶變異；②耐藥性質(zhì)粒出現(xiàn)；③細(xì)菌細(xì)胞膜通透性下降、藥物主動外排以及細(xì)菌生物被膜產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度減少。細(xì)菌耐藥通常多機制連同作用，同時FQs類藥物作用機制大多相同，故常出現(xiàn)交叉耐藥性。

2.3 FQs類藥物殘留及危害

隨著畜牧業(yè)快速發(fā)展，F(xiàn)Qs類藥物在治療和預(yù)防動物疾病、促進(jìn)動物生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率上得到廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致FQs類藥物的原形及其代謝產(chǎn)物可蓄積或貯存于動物的細(xì)胞、組織、器官或可食性產(chǎn)品（如蛋、奶等）中，形成了藥物殘留。這些動物性食品中的藥物殘留將隨著食物鏈進(jìn)入人體，對人類的健康構(gòu)成潛在威脅，如皮疹、過敏性休克等不良反應(yīng)，并會抑制人體腸道中正常的敏感菌群生長以及導(dǎo)致致病菌產(chǎn)生耐藥性，同時還可能存在致癌性。

因此，聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織、歐盟、日本等都將FQs類藥物列入限制使用的獸藥名單，并已制定出相應(yīng)的最高殘留量(MRLs)，我國也于2002年規(guī)定了獸用FQs類藥物的MRLs，見表1。

表1 我國農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定獸用氟喹諾酮類藥物的MRLs

（續(xù)表）

3 FQs類藥物殘留的檢測方法

目前國內(nèi)外用于檢測FQs類藥物殘留的方法主要有微生物檢測法、色譜儀器分析法、免疫分析法和化學(xué)發(fā)光與電化學(xué)發(fā)光分析法。

3.1 微生物檢測法

微生物檢測法是應(yīng)用最早的方法，適用于對畜禽組織中的抗菌藥物進(jìn)行篩選檢驗。其檢測原理是基于FQs類藥物對微生物的生理機能、代謝的抑制作用，可定性或定量確定樣品中FQs類藥物的殘留。微生物檢測法具有相關(guān)性好、檢測藥物廣泛、預(yù)處理簡單、成本低廉和適用大量樣品篩選等優(yōu)點，但存在檢出限過高、靈敏度較低、特異性不強、耗時較長等不足。1998年，Okernman等[1]利用改良的歐洲四平皿法檢測市售肉品中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留。在國內(nèi)，黃曉蓉等[2]采用E.coliATCC8739為檢測菌建立檢測鰻魚及其制品中FQs藥物殘留的微生物法，發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、其他喹諾酮類藥物的檢測限分別為20μg/kg、25μg/kg、50-250μg/kg，其中恩諾沙星的回收率為75.89％-83.12％。陳曦等[3]以金黃色葡萄球菌、短小芽孢桿、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌5種菌為工作菌，建立了3種FQs類藥物(恩諾沙星、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星)殘留的微生物檢測法，并利用利血平對3種藥物的增敏作用，有效地增加FQs類藥物的檢出率，提高微生物檢測法的靈敏度。最近報道，Orlando Nagel等采用3種抗生素高敏感型細(xì)菌（嗜熱脂肪肚芽胞桿菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草桿菌），以半定量微滴板法準(zhǔn)確區(qū)分牛奶中喹諾酮類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類和磺胺類4大類抗生素殘留，該法的亮點是將傳統(tǒng)MPMS耗時24h縮短到6h，實用性更強[4]。

3.2 色譜儀器分析檢測法

3.2.1 高效液相色譜法（HPLC）

HPLC是在經(jīng)典液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展而來，通過高分離效能的色譜柱和高靈敏度的紫外線、熒光或二極管陣列檢測器達(dá)到分離、檢測FQs類藥物殘留目的。HPLC是目前最常用的檢測方法，具有分離度好、準(zhǔn)確性高、專屬性強和操作自動化高等優(yōu)點，但也存在溶劑消耗量大、儀器價格高、前處理復(fù)雜等缺點。葉鹿鳴等[5]采用HPLC法檢測牛奶中環(huán)丙沙星、雙氟沙星和沙拉沙星3 種FQs殘留，將樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖液稀釋、超聲提取，用Waters Oasis?HLB固相萃取小柱進(jìn)行濃縮、凈化，供HPLC分析；流動相為甲醇-乙腈-12％甲酸(15：15：70)；激發(fā)波長275nm，發(fā)射波長445nm；在0.1-5.0mg/L范圍內(nèi)3種FQs關(guān)系線性良好，回收率在90.0％-102.0％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1％ -10.0％，檢出限分別為0.02 mg/L、0.015 mg/L和0.02 mg/L。胡煜等[6]采用基質(zhì)固相分散法結(jié)合HPLC-DAD檢測豬肉組織中的依諾沙星和洛美沙星殘留，在0.1-1.0μg/L范圍內(nèi)，2種FQs關(guān)系線性良好，回收率在80.6％-99.2％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于6.1％，檢出限分別為7μg/ kg-34 μg/kg。該方法同時還檢測出2種磺胺類藥(對氨基苯磺酰胺、新諾明)和1種四環(huán)素(四環(huán)霉素)。

3.2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)

隨著質(zhì)譜（MS）的發(fā)展和普及，利用LC-MS 和LC-MS/MS等技術(shù)可以得到特異性更強、靈敏度極高和分析范圍更廣的結(jié)果。因此，2008年LC-MS被列為水產(chǎn)品中15種FQs類藥物殘留檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)。焦豪妍等[7]建立固相萃取- HPLCMS/MS法測定牛奶中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星和蘆氟沙星殘留量；牛奶樣品經(jīng)乙酸酸化、乙腈沉淀蛋白質(zhì)后，過C18固相萃取小柱凈化，在氮氣下濃縮干燥，以甲醇-10mmol/L醋酸銨水溶液(25：75)為流動相溶解殘渣，渦旋后轉(zhuǎn)移上清液供 HPLC-MS/MS分析測定；結(jié)果表明5種藥物在0.5-200ng/g濃度范圍內(nèi)色譜響應(yīng)線性關(guān)系良好(r＞0.99)，最低響應(yīng)值為0.5ng/g。Yu等[8]利用快速溶劑萃取結(jié)合HPLC-MS/MS法同時測定了不同動物性食品中15種FQs類藥物，將樣品經(jīng)乙腈提取，用Waters Oasis?HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化，供 HPLC-MS-MS分析，在10-800μg/ kg范圍內(nèi)15種FQs關(guān)系線性良好，回收率在70.6％-111.1％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15％。

3.2.3 高效薄層色譜法( HPTLC)

HPTLC是將HPLC結(jié)合經(jīng)典的薄層色譜法。在藥物殘留分析上，因其分離分析速度快，對樣品預(yù)處理要求低，操作簡單，適合樣品的高通量篩選分析。Shital等[9]建立一種測定血漿中氧氟沙星的HPTLC確證分析方法，樣品經(jīng)三氯乙酸沉淀，用毛細(xì)管Linomat IV自動進(jìn)樣器取上清液于F254硅膠板，以正丁醇-甲醇-氨水(6：1：3)為展開劑，295nm下紫外檢測，線性回歸率在88.10％左右。

3.2.4 高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)

HPCE是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，與HPLC法相比，它不受運行緩沖液的酸、堿性和其中表面活性劑等添加劑的影響，具有樣品用量少、分析速度快、分離效率高、運行成本低、適用范圍廣等特點，有利于實際樣品的分析。Yang等[10]利用區(qū)帶毛細(xì)管電泳法結(jié)合非接觸式電導(dǎo)耦合檢測技術(shù)對酸性緩沖液中的蘆氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、加替沙星和莫西沙星5種FQs藥物進(jìn)行了分析，遷移時間和峰面積的日內(nèi)RSD分別為0.65％和12.3％，日間RSD分別為 1.28％和 8.8％，最低響應(yīng)值為6.8-11.7ng/g。研究表明該方法適用于復(fù)雜基質(zhì)內(nèi)FQs藥物的快速檢測。

3.3 免疫分析檢測法(ELISA)

ELISA是以抗原或半抗原和抗體特異性結(jié)合為抗原-抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的生化測試技術(shù)，目前主要有間接競爭 ELISA 法、在線免疫親和色譜法和免疫傳感器法3種。Gobbo等[11]用環(huán)丙沙星與牛血清蛋白偶連，4次免疫新西蘭雌性家兔，從家兔耳邊緣靜脈取血，離心提取血清，經(jīng)PTA-ELISA方法測定，用堿性磷酸(酯)酶和辣根過氧化物酶顯色，所得數(shù)據(jù)用Packard系統(tǒng)軟件統(tǒng)計，能有效檢測家畜體內(nèi)環(huán)丙沙星殘留量。用此方法還可檢測其他的FQs類獸藥，如諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星。

3.4 化學(xué)發(fā)光(CL)與電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測法

CL是借助FQs類藥物分子吸收化學(xué)反應(yīng)釋放的能量發(fā)生能級躍遷，在電子回到基態(tài)中產(chǎn)生光輻射來進(jìn)行定性定量分析的方法。該法反應(yīng)裝置簡單，檢測靈敏度高，光學(xué)系統(tǒng)簡單，背景信號干擾小，適用于復(fù)雜樣品的定性定量分析。常見的CL有敏化化學(xué)發(fā)光法、紫外分光光度法和熒光法等。如馮仕云等[12]采用熒光法結(jié)合化學(xué)計量學(xué)(主成分分析、偏最小二乘法和偏最小二乘判別)來建立牛奶中單諾沙星殘留的快速檢測定性定量模型，定性模型可以準(zhǔn)確區(qū)分樣品陰性與陽性，定量模型預(yù)測回收率在91％-110％，預(yù)測誤差在可接受范圍；同時該方法的檢出限為0.246μg/L，定性檢測的靈敏度達(dá)到100％。ECL是將CL與電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的一種新的分析方法，對比CL具有更好的選擇性。常見的ECL有膠束電動毛細(xì)管電泳法、示波極譜法和吸附溶出伏安法等。

4 結(jié)語

由于在獸醫(yī)臨床和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用以及其殘留問題，F(xiàn)Qs類藥物殘留檢測技術(shù)越來越受到研究工作者的重視。比較FQs類藥物4種主要檢測方法，其中微生物檢測法預(yù)處理簡單、成本低廉，但存在檢測限過高、特異性不強，主要適用大量樣品初次篩選；色譜儀器分析法以其高效、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點成為當(dāng)前檢測的主流方法，但同時也有預(yù)處理復(fù)雜，儀器價格昂貴，不適宜大規(guī)模普及；CL和ECL法原理復(fù)雜，數(shù)據(jù)分析繁瑣，實用性不強；ELISA法具有靈敏度高、特異性強、處理簡便等優(yōu)點，并且隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展，專一性單抗和多殘留檢測試劑盒的出現(xiàn)，在不久ELISA法必將取代色譜檢測法成為FQs類藥物最常用檢測法。

［1］Okerman L, Hoof J V, Debeuckelaere W. Evaluation of the European Four-plate Test as a tool for screening antibiotic residues in meat samples from retail outlets[J]. AOAC Int, 1998, 81(1)：51-56.

［2］ 黃曉蓉，鄭晶，李壽崧，等. 鰻魚及其制品中喹諾酮類藥物殘留的微生物快速檢測方法[J].淡水漁業(yè)，2005，35 (4)，3-6.

［3］ 陳曦，朱良強. 利血平增敏微生物法檢測三種氟喹諾酮類藥物殘留的研究[D]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［4］Orlando Nagel, Maria Pilar Molina, Rafael Althaus. Microbiological system in microtitre plates for detection and classification of antibiotic residues in milk[J]. International Dairy Journal, 2013, 32：150-155.

［5］ 葉鹿鳴，謝東華. 高效液相色譜熒光檢測法測定牛奶中3種氟喹諾酮殘留研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18(5)：804-806.

［6］ 胡煜，許慕，迎梅胡. 通過MSPD和HPLC-DAD測定豬肉組織中的氟喹諾酮類，磺胺類和四環(huán)素類多殘留[J]. 藥物分析雜志，2012，2(1)：76-81.

［7］ 焦豪妍，許風(fēng)國，田媛，等. 固相萃取-LC- MS/MS測定牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，40 (1)：62-66.

［8］Yu H, Tao Y, Chen D. Simultaneous determination of fluoroquinolones in foods of animal origin by a high performance liquid chromatography and a liquid chromatography tandem mass spectrometry with accelerated solvent extraction [J]. Journal of Chromatography B, 2012, 885：150-159.

［9］Shital S, Nikhil A, Khisti. High performance thin layer chromatographic determination of Ofloxacin in plasma[J]. Asian J Pharm Clin Res, 2012, 5(2)：23-25.

［10］Yang Z, Qin W. Separation of fluoroquinolones in acidic buffer by capillary electrophoresis[J]. J Chromatogr A, 2009, 1216(27)：5327-5332.

［11］Gbbo S P, Longo C, Bueno I C S. Production of polyclonal antibody for ciprofloxacin detection in Brazilian livestock [J]. Proceedings of the British Society of Animal Science, 2003, 84(2)：66-75.

［12］馮仕云，張燕萍，劉小鳴，等. 基于熒光法的牛奶中單諾沙星的快速檢測方法[J]. 食品工業(yè)科技，2013，34(7)：335-364.

Progress in Fluoroquinolones Residue Detection Methods

Wang Jingjing1,4, Xu Changxu2, Huang Huaguo3, Lu Zhibo4
1.Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Ningbo, Zhejiang, 315012; 2.China Pharmaceutical University; 3.Dongtou Product Quality Supervision and Inspection; 4.College of Environmental Science and Engineering, Tongji University)

As a broad-spectrum antimicrobial drug, fl uoroquinolone has been widely used in animal husbandry and aquaculture industry at home and abroad. However, its standard-exceeded residues harmful to human health hazard exists, and this problem has aroused more and more attention. In this paper, the characteristics of fl uoroquinolones residue detection methods and it’s four categories were reviewed.

Fluoroquinolones; Characteristics; Residues

S859.83