多肽藥物固相合成中的水解雜質(zhì)和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的研究

郜炎龍，吳超柱，徐凡，姜和，2

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物學(xué)院，重慶 400050;

2.重慶前沿生物技術(shù)有限公司，重慶 400041)

多肽藥物固相合成中的水解雜質(zhì)和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的研究

郜炎龍1，吳超柱1，徐凡1，姜和1，2

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物學(xué)院，重慶 400050;

2.重慶前沿生物技術(shù)有限公司，重慶 400041)

對多肽固相合成中水解雜質(zhì)和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行研究。介紹了多肽合成中氨基酸水解機(jī)制和消旋機(jī)制，從合成原料、質(zhì)量控制、工藝過程控制和檢測方法選擇等方面為多肽合成研究者提供參考。結(jié)果表明:某些氨基酸水解產(chǎn)生的水解雜質(zhì)和消旋產(chǎn)生的非對映異構(gòu)體雜質(zhì)是多肽藥物的重要有關(guān)物質(zhì)之一，因此應(yīng)加強(qiáng)對水解雜質(zhì)和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的研究與控制。

多肽固相合成;雜質(zhì);水解;非對映異構(gòu)體

多肽的化學(xué)合成最初始于液相合成，但由于液相合成多肽每一步都要進(jìn)行純化和分離，因此在實(shí)際操作時(shí)受到很大的限制。1963年美國化學(xué)家Merrifield［1］發(fā)表了第一例用固相樹脂作為載體合成四肽化合物(Leu－Ala－Gly－Val)的文章，標(biāo)志著固相有機(jī)合成化學(xué)時(shí)代的開始，也實(shí)現(xiàn)了固相合成多肽的規(guī)?；a(chǎn)。如今固相合成法已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和多肽研究領(lǐng)域。固相合成的基本原理是以連接在固相載體的首個(gè)氨基酸為起點(diǎn)，經(jīng)脫除保護(hù)基團(tuán)、活化、耦連的循環(huán)過程，將氨基酸逐一連接得到目的多肽［2－3］。由于肽鏈中某些氨基酸(如Gln、Asn)或多肽藥物的修飾基團(tuán)存在側(cè)鏈酰胺鍵，在合成過程中難免會遇到酸堿環(huán)境或有水分的環(huán)境，造成部分水解，而水解產(chǎn)物與目標(biāo)產(chǎn)物分子量和LC/MS信息相差很小，常規(guī)的有關(guān)物質(zhì)檢查方法通常并不能將其良好地檢出。另外由于氨基酸多為手性物質(zhì)(除Gly)，在合成多肽過程中，在氨基酸的官能團(tuán)參與保護(hù)基的接入及脫除、羧基活化等反應(yīng)時(shí)可能發(fā)生消旋化反應(yīng)，這可能導(dǎo)致肽分子立體化學(xué)信息的缺失。由于多肽藥物的藥理活性與立體構(gòu)型緊密相關(guān)，因此須對多肽合成中的非對映異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行控制和研究。另外，非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的色譜特征多與主成分非常相似，常見的物質(zhì)檢查方法也難將它較好地分離檢出。本文闡述多肽固相合成中氨基酸側(cè)鏈酰胺鍵以及常見修飾基團(tuán)的水解和消旋化機(jī)制，綜述水解雜質(zhì)和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)當(dāng)前的研究技術(shù)與進(jìn)展，最終對兩類雜質(zhì)的控制與研究進(jìn)行分析討論，并提出合理建議。

1 水解機(jī)制和消旋化機(jī)制

1.1 水解機(jī)制

1.1.1 水解影響因素與機(jī)制

多肽藥物在不同的環(huán)境中可以被酸、堿、蛋白酶催化［4］或被金屬離子催化水解［5］。例如，在25℃的溫度下，二肽甘氨酰甘氨酸在1 mol/L NaOH中水解的半衰期約為2天，在1 mol/L鹽酸中水解的半衰期則為150天［6］。而難活化的肽鍵在鈀［7］和銅［8］配合物的催化下能迅速裂解。過去非催化肽鍵水解并未得到較多關(guān)注，直到1988年Kahne和Still用14C標(biāo)記了甘氨酸并使其結(jié)合在肽C－末端，在中性pH值范圍內(nèi)和25℃的溫度下能監(jiān)測到釋放少量的甘氨酸，它的水解速率為3× 10－9s－1，從而推算得出它的半衰期為7年［9］。

1)pH因素

多肽藥物在酸性和堿性條件下易水解，在中性條件下水解速率最低。Kahne和Still用14C標(biāo)記了一個(gè)四肽的C－末端甘氨酸，在pH值為0到14的范圍內(nèi)和25℃的溫度下［10］，測定多肽的水解情況，并繪制出了水解速率和pH值的曲線關(guān)系(如圖1所示)。其中:在pH=7時(shí)多肽的水解速率為3 ×10－9s－1，從而推算得出它的半衰期為7年。

圖1 Kahne等測定的四肽水解與pH的曲線關(guān)系

2)溫度因素

多肽藥物在高溫下的水解速率明顯快于室溫下的水解速率。兩者相差較大，一般相差在103～105倍。Kahne和Still用14C標(biāo)記了一個(gè)四肽，測定該四肽在熱冷不同樹脂下的水解情況?？梢钥吹?，盡管隨著時(shí)間的推移熱樹脂的水解始終大于冷樹脂水解，但在1 500 min后保持相對平衡［9］。Radzicka等檢測了5種二肽在150℃和25℃下的水解速率，發(fā)現(xiàn)150℃下的水解速率約為25℃下的105倍［11］，如圖2和表1所示。

圖2 Kahne等測定的四肽在熱冷不同背景下水解速率隨時(shí)間變化的曲線關(guān)系

表1 Anna Radzicka等測定的5種二肽在150℃和25℃下的水解速率(G為甘氨酸)

3)酶催化因素

多肽藥物不同位置的肽鍵需要采用不同的酶和不同的溫度進(jìn)行水解，而且不同位置的水解速率也不相同。表2所示為Radzicka等根據(jù)前人檢測的C－端肽鍵(如AcGG)與羧肽酶B (23℃)［12］、內(nèi)部肽鍵(如AcGGNHMe)與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(37℃)［13］、二肽鍵(如GG)與腹水瘤二肽酶(40℃)［14］3個(gè)位置肽鍵的水解速率以及半衰期。再加上檢測3類肽鍵在無酶催化條件下的反應(yīng)速率與酶催化后的水解速率，最終得出結(jié)論:羧肽酶B是這3類酶中催化能力最強(qiáng)的酶［11］。

表2 Anna Radzicka等測定的C端肽鍵、內(nèi)部肽鍵、二肽鍵的水解速率(G:甘氨酸、Knon為無酶條件下反應(yīng)速率)

4)金屬離子催化因素

Kopera等對7類序列的多肽(R1－Ser－Arg－His－Trp－R2，R1－Ser－Lys－His－Trp－R2，R1－Ser－Ala－His－Trp－R2，R1－Ser－Arg－His－Ala－R2，R1－Ser－Gly－His－Ala－R2，R1－Thr－Arg－His－Trp－R2，R1－Thr－His－His－Trp－R2)，在鎳離子催化下的水解進(jìn)行了研究，最終推斷出R1－(S/T)XHZ－R2肽在鎳離子催化下的水解機(jī)制(S為絲氨酸，T為蘇氨酸，H為組氨酸，X為丙氨酸或組氨酸，Z為賴氨酸，R1、R2為非特定序列)［15］。在鎳離子作用下，形成了2個(gè)五元雜環(huán)和1個(gè)六元環(huán)的過渡態(tài)物質(zhì)，如圖3所示。

圖3 Kopera等推斷出R1－(S/T)XHZ－R2肽在鎳離子催化下的水解機(jī)制

1.1.2 水解位置與機(jī)制

多肽藥物的水解按水解位置主要分為4類:肽鏈全水解、肽鏈部分水解、主鏈氨基酸的側(cè)鏈酰胺鍵水解、修飾基團(tuán)水解。

1)肽鏈全水解

肽鏈全水解的化學(xué)方法有酸水解和堿水解。

①酸水解:一般用6 mol/L HCl或4 mol/L H2SO4回流20 h左右可完全水解，不引起消旋，得到的是L－型氨基酸。陳平等［16］采用毛細(xì)管水解多肽法，將多肽樣品溶解在20 μL的5.7 mol/L鹽酸(含0.5%苯酚)或4 mol/L甲磺酸(含0.2%色胺)中，再加入5 μL亞二硫基二乙酸(10 mg/ml，溶于0.2 mol/L Na0H中)，用微量注射器將其導(dǎo)入一個(gè)下端封閉毛細(xì)管中(1mmi.d)，然后將管子在液體彎月面上部1 cm處封閉，封好的管子于150℃保溫2 h。毛細(xì)管酸水解法能夠防止氨基酸氧化降解。

②堿水解:多肽與5 mol/L NaOH共煮10～20 h，完全水解，多數(shù)氨基酸被不同程度地破壞，如精氨酸脫氨，得到的是L型和D型的混合物。由于此方法得到的氨基酸多數(shù)遭到破壞，不建議采用此法全水解。

2)肽鏈部分水解

多肽藥物發(fā)生部分水解的位置是羧基中的碳原子和氨基中的氮原子相連的肽鍵。多肽部分水解后生成短的多肽。此類水解中易發(fā)生水解的位點(diǎn)可能是天冬氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、蘇氨酸等。魯偉等［17］用胰蛋白酶將蛋白質(zhì)部分水解為多肽后，利用三氯乙酸法和雙縮脲法確定了其水解液中的多肽含量。

3)修飾基團(tuán)水解

修飾基團(tuán)水解的反應(yīng)類型主要包含鹵代烴水解，酯水解，有機(jī)物鹽類水解(醇鈉、酚鈉、羧酸鈉)，糖類水解，油脂類水解等，如下所示:

4)主鏈氨基酸的側(cè)鏈酰胺鍵水解

這類水解的反應(yīng)原理很簡單，即:AA1－CONH2+H2O→AA1－COOH+NH3。易發(fā)生此類反應(yīng)的常見氨基酸為Gln、Asn。此類反應(yīng)不破壞主鏈結(jié)構(gòu)，最終使多肽水解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量僅增加1，色譜信息和質(zhì)譜信息與原多肽非常接近，因此是一類較難分離的雜質(zhì)，應(yīng)重點(diǎn)選擇此類雜質(zhì)作為研究和質(zhì)控對象。

綜上所述，多肽水解易受pH值、溫度、蛋白酶和金屬離子催化等因素影響。在水解位置影響因素中，全水解得到的是單個(gè)氨基酸，部分水解得到的是短肽，而修飾基團(tuán)水解因?yàn)楸凰饣鶊F(tuán)的不確定性，水解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量一般變化比較大(除水解基團(tuán)為酰胺鍵外)。三者的水解產(chǎn)物與目標(biāo)產(chǎn)物的色譜和質(zhì)譜信息相差甚遠(yuǎn)，因此，在雜質(zhì)分離研究中不具有實(shí)際意義。本文重點(diǎn)研究氨基酸側(cè)鏈酰胺鍵和修飾基團(tuán)酰胺鍵的水解。

1.2 消旋化機(jī)制

肽化學(xué)中的“消旋化”是指一個(gè)手性中心部分或全部差向異構(gòu)化，導(dǎo)致其旋光性信息發(fā)生改變。消旋化機(jī)制主要有直接烯醇化機(jī)制和5(4H)－噁唑酮機(jī)制。

1.2.1 直接烯醇化機(jī)制

在肽縮合時(shí)，堿催化的烯醇化機(jī)制起主要作用，消旋程度取決于活化羧基α位質(zhì)子的酸性、溶劑、溫度及堿的性質(zhì)。氨基酸α位質(zhì)子的酸性與取代基的性質(zhì)緊密相關(guān)［18］。直接烯醇化機(jī)制見圖4。

圖4 活化的氨基酸和肽的堿催化消旋機(jī)制(A)和酸催化消旋機(jī)制(B)

1.2.25 (4 H)－噁唑酮機(jī)制

5(4 H)－噁唑酮(D/L－4)產(chǎn)生在氨基酸活化過程中，是肽合成的重要中間體，其化學(xué)構(gòu)型的不穩(wěn)定也是導(dǎo)致氨基酸消旋化的重要因素?；衔?中活化基X的活化能力及N－酰基R1－CO－的電子特征與噁唑酮的形成傾向緊密相關(guān)。噁唑酮的氨解速率和它的形成能力決定了肽耦合反應(yīng)的消旋程度。氨基組分的親核能力也對多肽縮合反應(yīng)有重要影響［18］。5(4H)－噁唑酮的消旋機(jī)制如圖5所示。

圖55 (4H)－噁唑酮的消旋機(jī)制

2 水解雜質(zhì)和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的研究方法和進(jìn)展

多肽藥物中的水解雜質(zhì)和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)都屬于多肽合成中的有關(guān)物質(zhì)，因此在分析方法上有相似性，但又有一定的差異性。如非對映異構(gòu)體可以采用手性色譜法，而水解雜質(zhì)則不能。

由于合成多肽中有關(guān)物質(zhì)的復(fù)雜性，且單一特定研究方法總會存在一定的局限性，因此對于新合成多肽的有關(guān)物質(zhì)研究而言，通常需同時(shí)結(jié)合使用不同原理的方法進(jìn)行研究。一般認(rèn)為，對合成多肽雜質(zhì)認(rèn)知的程度與研究中使用的獨(dú)立技術(shù)的數(shù)量成正比。常見的合成多肽的有關(guān)物質(zhì)研究方法包括基于各種不同原理的高效液相色譜法(如反相HPLC法、離子交換HPLC法、分子排阻HPLC法)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，毛細(xì)管電泳，液質(zhì)聯(lián)用法以及激光散射等［19］。下面將介紹幾種常用的分析水解雜質(zhì)和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的方法。

2.1 反相高效液相色潽法(RP－HPLC)

合成多肽中水解雜質(zhì)和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的研究與其他化學(xué)藥物的有關(guān)物質(zhì)研究相同，也可采用HPLC進(jìn)行檢測。最常用的是反相色譜法(RP－HPLC)，采用C18、C8或C4柱等［18］。RPHPLC具有極高的分辨率，已廣泛應(yīng)用于多肽和蛋白的分離。由于多肽在疏水性固定相表面上的吸附與解吸不僅取決于氨基酸序列，而且與其空間結(jié)構(gòu)有關(guān)，即“疏水腳”的細(xì)微差別將使構(gòu)象不同的多肽具有不同的色譜保留行為［20］，因此RPHPLC可有效分離序列幾乎完全相同的多肽及多肽的消旋化產(chǎn)物［21－23］。

陳平等［16］采用毛細(xì)管在亞二硫基二乙酸存在下用甲磺酸對蛋白質(zhì)與多肽水解進(jìn)行氨基酸分析。亞二硫基二乙酸的加入可穩(wěn)定半胱氨酸［24］，采用含色胺的甲磺酸水解可以保護(hù)色氨酸。最終應(yīng)用反相高效液相色譜法RP－HPLC成功分離了多肽的水解產(chǎn)物。

張若蘅等［25］應(yīng)用反相高效液相色譜法RPHPLC研究了5對L，D－多膚非對映異構(gòu)體在不同條件下的分離情況。通過改換色譜柱、改變流動(dòng)相的組成及梯度洗脫條件，發(fā)現(xiàn)其中的2對可以得到較好的分離。Boc－Ala－L，D－Ala－GlyOBzl在Synchropak RP－P(250×4.5 mm i.d.)柱上，梯度為20%～60%的0.1%TFA/MeCN(20 min)時(shí)的分離度為1.l;Boc－Gly－L，D－Ala－Val OBzl在Novapak C18(3.9×150 mm i.d.)柱上，以30%的0.1%TFA/MeCN恒流動(dòng)相組成進(jìn)行分離時(shí)得到的R值高達(dá)1.6。

齊崴等［26］采用水(0.1%TFA)和乙腈(0.1% TFA)流動(dòng)相梯度洗脫，在C18柱的色譜系統(tǒng)下對使用固相合成的肽H2N－PFNSLAI－COOH進(jìn)行了研究。通過優(yōu)化色譜條件，可將4種非對映異構(gòu)體分離，并利用MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2.2 離子交換色譜法(HPIEC)

伴隨肽鏈的增長，一些氨基酸消旋產(chǎn)生的非對映異構(gòu)體雜質(zhì)采用反相色譜系統(tǒng)難以有效檢出，建議根據(jù)樣品的理化特性嘗試應(yīng)用其他不同原理的色譜檢測系統(tǒng)，如毛細(xì)管電泳法(HPCE)、離子交換色譜法等。

迄今為止，離子交換色譜法被認(rèn)為是在低到中壓條件下分離多肽水解產(chǎn)物的較好方法。1993年金貴仙等［27］用NaAc溶液作起始緩沖溶液，含NaAc的NaCl溶液作終止緩沖溶液，在CM－52陽離子纖維素柱上從水解膠原多肽中分離出了4個(gè)組分。之后岳愛兵等也在該柱上對明膠中的不同構(gòu)象組分進(jìn)行了分離。

某肽鏈長度為三十肽以上的創(chuàng)新多肽藥物在研發(fā)的初期，采用反相色譜檢測樣品純度為97.8%，但當(dāng)采用強(qiáng)陽離子交換色譜法(SCXHPLC)測定純度時(shí)僅為88.0%，其中組氨酸的差向異構(gòu)體雜質(zhì)高達(dá)9.8%。后經(jīng)改進(jìn)優(yōu)化制備工藝，較好地控制了組氨酸差向異構(gòu)體雜質(zhì)含量［28］。

2.3 手性色譜柱法

手性色譜柱(Chiral HPLC Columns)是將具有光學(xué)活性的單體固定在硅膠或其它聚合物上制成手性固定相(chiral stationary phases)，通過將對映異構(gòu)體引入到手性環(huán)境中，使其呈現(xiàn)出物理特征的差異，進(jìn)而達(dá)到拆分光學(xué)異構(gòu)體的目的。因此手性色譜在分離對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體時(shí)有獨(dú)特優(yōu)勢。

Hamase等［28－30］采用Pirkle型手性柱Sumichiral OA－2500S，以檸檬酸甲醇溶液為流動(dòng)相成功地分離過NBD－氨基酸對映異構(gòu)體。在同樣條件下，NBD－D，L－Thr和NBD－D，L－allo－Thr這2對對映體也非常容易分離。宋志峰等［31］采用手性色譜法結(jié)合熒光法檢測將DAP(細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖短肽鏈上的第三位氨基酸)的3種非對映異構(gòu)體(即左旋(LL)、右旋(DD)和內(nèi)消旋型(meso))良好地分離。

2.4 液質(zhì)聯(lián)用法(LC/MS)

液質(zhì)聯(lián)用(HPLC－MS)又叫液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。HPLC－MS體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，將液相色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力和MS擁有高靈敏度、高選擇性及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)完美地結(jié)合起來。

陳媛等［32］通過使用HPLC－MS/MS方法分別對天然發(fā)酵醬油原油和酸水解植物蛋白液中的多肽的水解氨基酸的含量和比例進(jìn)行了研究，準(zhǔn)確得出了水解后氨基酸的種類和含量。

Goodlett等［33］采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定了多肽樣品的光學(xué)純度。先將肽樣品溶于DCl/ CD3COOD中，進(jìn)行水解然后采用N－a－(2，4－二硝基－5－氟苯基)－L－丙氨酰胺(FDAA，Marfey’s試劑)對處理后的氨基酸進(jìn)行衍生化，使用普通的反相高效液相色譜或氣相色譜即可較好地分離衍生化后的D和L－構(gòu)型的氨基酸，進(jìn)而檢測得到肽樣品中氨基酸消旋的含量。水解時(shí)必須使用氘(D)代試劑，這樣可以使水解反應(yīng)過程中產(chǎn)生的消旋氨基酸的α位質(zhì)子為氘(D)，利用ESI－MS檢測能將水解反應(yīng)中產(chǎn)生的消旋與多肽中本身的氨基酸消旋較好地區(qū)分開來。此方法有良好的專屬性，可以廣泛地應(yīng)用，能檢測各種多肽藥物。目前，國外研究人員已廣泛應(yīng)用此類方法對多肽藥物合成中的光學(xué)純度進(jìn)行控制［34］，并且通過此方法指導(dǎo)制備工藝的優(yōu)化改進(jìn)。

綜上所述，水解雜質(zhì)適用于除手性色譜法外的其他各種常見色譜法，尤其適用于反相高效色譜法。非對映異構(gòu)體雜質(zhì)在短肽時(shí)適用于反相高效液相色譜法，但隨著肽鏈增加反相色譜系統(tǒng)常常無法有效檢出，建議采用離子交換色譜法。當(dāng)含有其他對映異構(gòu)體雜質(zhì)或者內(nèi)消旋體時(shí)應(yīng)采用手性色譜法。液質(zhì)聯(lián)用時(shí)可以根據(jù)所檢測分析物質(zhì)的特性，采用適合的色譜柱對水解雜質(zhì)和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行分離，并通過質(zhì)譜法進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證。

3 對水解雜質(zhì)和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的控制和研究的建議

3.1 加強(qiáng)合成的起始原料的質(zhì)量控制

加強(qiáng)合成的起始原料的質(zhì)量控制是非常必要的，因?yàn)楹铣啥嚯牡膫?cè)鏈酰胺鍵和各手性中心直接來源于合成起始原料——各種保護(hù)氨基酸［35－36］。起始物料的氨基酸及其衍生物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一般包括化學(xué)純度、熔點(diǎn)、性狀、比旋度、含量、光學(xué)純度及色譜純度等。其中起始原料的化學(xué)純度和光學(xué)純度的質(zhì)量控制是最為重要的2個(gè)指標(biāo)。

關(guān)于水解雜質(zhì)，由于原料氨基酸多保存在－20℃冰箱中，在反應(yīng)前轉(zhuǎn)移到干燥器中進(jìn)行復(fù)溫和干燥，因此除了在合成前進(jìn)行必要的化學(xué)純度質(zhì)檢外，在復(fù)溫時(shí)應(yīng)保證復(fù)溫時(shí)間和干燥器的內(nèi)硅膠的干燥活性，從而確保氨基酸恢復(fù)到室溫和復(fù)溫過程中冷凝的水蒸氣能完全被吸收，避免原料在反應(yīng)前發(fā)生水解。

關(guān)于非對映異構(gòu)體雜質(zhì)，目前多數(shù)多肽合成單位僅對起始原料比旋度進(jìn)行質(zhì)量控制。由于比旋度檢查方法在靈敏度、專屬性方面存在不足，此項(xiàng)指標(biāo)并不能對氨基酸的光學(xué)純度進(jìn)行有效的控制，尤其是遇到比旋度絕對值較小的氨基酸時(shí)，如Fmoc－Gln(Trt)－OH為－1.0°(±0.8°)(C=1，甲醇)、Fmoc－Glu(OtBu)－OH為+1.2°(±0.5°)(C =1，乙酸乙酯)。因此，本文提倡采用專屬性更強(qiáng)的手性高效液相色譜法來控制起始原料的光學(xué)純度。

3.2 注意控制工藝流程

多肽合成中的工藝流程和試劑選擇都對水解雜質(zhì)和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的產(chǎn)生有重要影響。

關(guān)于水解雜質(zhì)，在多肽合成中應(yīng)注意溶劑DMF易吸水、稱量氨基酸和縮合劑在外暴露吸水、投料前冰浴活化時(shí)氨基酸活化液易吸水的問題。DMF和DCM是多肽固相合成中大量使用的溶劑，但是二者易吸水，尤其是DMF可與水任意比互溶，常溫下放置24 h，吸水率達(dá)到0.25%。因此溶劑在放置時(shí)一般要加入分子篩保持干燥，投料溶解氨基酸和縮合劑時(shí)應(yīng)盡可能縮短暴露在空氣中的時(shí)間。氨基酸和縮合劑暴露在空氣中時(shí)也易吸水，所以要盡可能縮短稱量時(shí)間。在多肽固相合成中，投料前的活化步驟中多要求在低溫條件下攪拌或搖勻，低溫和攪拌都增大吸水的風(fēng)險(xiǎn)，因此應(yīng)盡量降低室內(nèi)濕度，縮小室溫與反應(yīng)溫度的溫差，盡可能地密封投料瓶并勻速攪拌，這樣有利于降低水解雜質(zhì)的產(chǎn)生。

關(guān)于非對映異構(gòu)體雜質(zhì)，由于多肽固相合成中消旋與肽鍵的形成是彼此競爭的，因而應(yīng)根據(jù)消旋的機(jī)制，注意縮合劑、氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的選擇，以及對反應(yīng)條件、投料比的考慮，盡可能降低多肽合成的消旋程度。例如關(guān)于肽鍵縮合的試劑和縮合方法的選擇。常見的縮合方法和試劑有碳二亞胺法、活化酯法、?；B氮物法、脲鎓鹽試劑法、磷鎓鹽試劑法、酸酐法等。以上縮合方法及縮合試劑都有各自特性:磷鎓鹽試劑中的BOP是一種比較高效的縮合劑，但反應(yīng)中易生成具有致癌性和強(qiáng)毒性的HMPA;疊氮法被認(rèn)為是目前最不易產(chǎn)生消旋化傾向的縮合方法;脲鎓鹽試劑中的HBTU和TBTU的縮合產(chǎn)率高，并且能減少甚至排除消旋及副反應(yīng)的發(fā)生;碳二亞胺化合物中的DCC價(jià)格較經(jīng)濟(jì)曾是常用的縮合劑，但它具有較高的C端差向異構(gòu)化和消旋化傾向;而當(dāng)DCC與HOBt等聯(lián)合使用時(shí)能有效地解決消旋化等問題，現(xiàn)在又得到了廣泛應(yīng)用。多肽合成研究者應(yīng)該充分了解這些縮合方法的特性，再結(jié)合目標(biāo)合成肽的現(xiàn)實(shí)情況(包含氨基酸側(cè)鏈的情況)選擇合適的縮合試劑與方法。當(dāng)肽鏈中含有苯丙氨酸、半胱氨酸、組氨酸等易消旋的氨基酸時(shí)，更須注意對合成工藝進(jìn)行研究。另外采用D－型的氨基酸制備異構(gòu)體對照樣品時(shí)，應(yīng)通過合適的色譜條件檢驗(yàn)當(dāng)前工藝下該氨基酸的消旋化程度，以指導(dǎo)優(yōu)化改進(jìn)此位點(diǎn)氨基酸的縮合工藝。例如，某多肽合成單位對四肽(NH2－His－Gly－Glu－Gly－COOH)固相合成中組氨酸縮合步驟的消旋程度進(jìn)行了研究，通過增加Fmoc－His(Trt)－OH的投料量、采用高效縮合劑的方法，加快了肽縮合的速率，降低組氨酸的消旋幾率。檢測結(jié)果表明此方法能將組氨酸的消旋降低一半左右。

3.3 優(yōu)化凍干、制劑、存儲和運(yùn)輸條件

在凍干、制劑、存儲、運(yùn)輸?shù)冗^程中，多肽藥物與一般化學(xué)藥物相比穩(wěn)定性差，由于所處環(huán)境的溫度、濕度、光照、pH值發(fā)生改變，很容易產(chǎn)生水解或消旋化反應(yīng)。因此需要根據(jù)肽類藥物穩(wěn)定性的特性選擇合適的考察項(xiàng)目與試驗(yàn)條件，進(jìn)行相關(guān)的穩(wěn)定性試驗(yàn)，得到多肽藥物的最適宜存儲條件，并根據(jù)最適宜的條件優(yōu)化凍干和制劑中的條件。比如，某新型抗艾多肽藥物在弱堿性條件中比較穩(wěn)定，則在凍干和制劑過程中應(yīng)盡可能避免酸性試劑和強(qiáng)堿性試劑的使用。因?yàn)榧幢愫罄m(xù)步驟中可以通過試劑酸堿中和調(diào)節(jié)pH值，但在pH值調(diào)和前往往易發(fā)生消旋化等不可逆反應(yīng);在存儲和運(yùn)輸中更是應(yīng)該杜絕酸性和強(qiáng)堿性環(huán)境，最終使藥物的純度和有效性得到保證。

與其他化學(xué)藥物不同，多肽藥物一般具有不同程度的表面活性，可能會與直接接觸藥物的容器和包裝材料發(fā)生吸附等相互作用，從而引起水解或消旋化反應(yīng)。例如玻璃表面的硅醇基能夠與某些多肽發(fā)生相互作用。因此，在選擇包裝材料時(shí)應(yīng)注意研究多肽藥物與包材的相互作用，有時(shí)可選用經(jīng)過特殊處理的包裝容器，如將容器的表面進(jìn)行硅烷化處理等。

4 結(jié)論與展望

某些氨基酸水解產(chǎn)生的水解雜質(zhì)和消旋產(chǎn)生的非對映異構(gòu)體雜質(zhì)是多肽藥物合成中一類重要的有關(guān)物質(zhì)，當(dāng)前大多數(shù)多肽合成容易忽視對這2類雜質(zhì)的控制。本文通過對合成多肽中氨基酸的水解和消旋進(jìn)行分析，提出了一些合理建議，要求采用合適的分析檢測方法研究多肽的水解雜質(zhì)和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)，通過加強(qiáng)起始原料質(zhì)量控制，改進(jìn)工藝過程的控制，優(yōu)化凍干制劑存儲運(yùn)輸?shù)臈l件，從而最終使多肽合成產(chǎn)業(yè)更好、更健康地發(fā)展。

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(責(zé)任編輯 何杰玲)

Hydrolysis Impurities and Diastereoisomeric Impurities in
Solid-phase Peptide Synthetic Drugs

GAO Yan－long1，WU Chao－zhu1，XU Fan1，JIANG He1，2
(1.School of Pharmacy and Biology，Chongqing University of Technology，Chongqing 400050，
China;2.Chongqing Frontier Biological Technology Co.Ltd.，Chongqing 400041，China)

This paper discusses the research and control of hydrolysis impurities and diaste－reoisomeric impurities in solid－phase peptide synthetic drugs development.The hydrolysis and racemic mechanisms during a peptide－bond－forming reaction were introduced.Recommendations were provided on quality control of synthetic materials，control of manufacturing process，and choice of analytical methods.Results show that hydrolysis and diastereoisomeric impurities are important parts of related substances in synthetic peptide drugs development.More attention should be paid to the research and control of hydrolysis impurities and dia－stereoisomeric impurities.

solid－phase peptide synthetic;impurity;hydrolysis;diastereoisomer

R512.91

A

1674－8425(2014)03－0069－08

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.03.013

2013－11－26

重慶市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2001ggc10003－29)

郜炎龍(1988—)，男，河南人，碩士研究生，主要從事多肽相合成與抗HIV藥物研究。

郜炎龍，吳超柱，徐凡，等.多肽藥物固相合成中的水解雜質(zhì)和非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的研究［J］.重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2014(3):69－76.

format:GAO Yan－long，WU Chao－zhu，XU Fan，et al.Hydrolysis Impurities and Diastereoisomeric Impurities in Solid－phase Peptide Synthetic Drugs［J］.Journal of Chongqing University of Technology:Natural Science，2014(3):69－76.