專一營(yíng)養(yǎng)與兼性甲烷氧化菌降解氯代烴的研究現(xiàn)狀、動(dòng)力學(xué)分析及展望

邢志林，張麗杰，趙天濤,2

1重慶理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400050 2重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院，重慶 400045

三氯乙烯 (Trichloroethylene, TCE)、四氯乙烯 (Tetrachloroethylene, PCE) 等氯代烯烴和氯仿 (Chloroform, CF)、三氯乙烷 (Trichloroethane,TCA) 等氯代烷烴的不當(dāng)使用給人類環(huán)境造成了嚴(yán)重污染[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)甲烷氧化菌能夠降解多種氯代烴類污染物[3-6]，甲烷單加氧酶(Methane monooxygenase，MMO) 在降解過(guò)程起著關(guān)鍵作用[7]。甲烷氧化菌能夠產(chǎn)生兩種類型的MMO：溶解甲烷單加氧酶 (Solution methane monooxygenase，sMMO) 和顆粒甲烷單加氧酶(Particulate methane monooxygenase，pMMO)[8]，由于兩種酶在底物范圍、底物親和性和對(duì)抑制劑敏感程度等方面的差異性，導(dǎo)致不同菌株催化降解氯代烴范圍和效率的不同。研究者已經(jīng)從各個(gè)方面對(duì)氯代烴的降解做了研究，包括甲烷氧化菌對(duì)不同氯代烴的降解效果[9-10]、氯代烴降解機(jī)理和其動(dòng)力學(xué)[11-12]以及氯代烴生物降解的實(shí)際應(yīng)用[13-14]等。

兼性甲烷氧化菌 (Facultative methanotrophs)與專一甲烷氧化菌相比有著獨(dú)特的生理學(xué)和底物選擇特性，因可以利用含碳碳鍵的有機(jī)物作為碳源和能源而更容易實(shí)現(xiàn)富集，已經(jīng)展現(xiàn)出廣闊的工程應(yīng)用前景[15-16]。兼性甲烷氧化菌能利用乙酸、丙酮酸、琥珀酸、蘋果酸和乙醇等多碳化合物[17-20]，且有些多碳化合物可被兼性甲烷氧化菌優(yōu)先利用，從而使得兼性甲烷氧化菌降解氯代烴日益成為了研究熱點(diǎn)。

對(duì)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)進(jìn)行調(diào)研，介紹甲烷氧化菌降解氯代烴的綜述性文獻(xiàn)并不多見(jiàn)。韓冰等[21]從現(xiàn)代生物技術(shù)角度介紹了甲烷氧化菌的分類與分布、MMO的結(jié)構(gòu)與功能，其中提及了氯代烴的生物降解但未做系統(tǒng)闡述；魏素珍[22]介紹了甲烷氧化菌種類及其在溫室氣體減排、污染物治理方面的應(yīng)用現(xiàn)狀和應(yīng)用前景，涉及了共代謝的概念及氯代烴對(duì)甲烷氧化的影響；鮑倫軍等[23]描述了多種降解鹵代烴菌株的降解特性、降解途徑等；Jiang等[24]、Brigmon[25]和Sermau[26]著重介紹了甲烷氧化菌在環(huán)境工程中的應(yīng)用前景和未來(lái)的發(fā)展方向，同時(shí)也提及了兼性甲烷氧化菌降解氯代烴類污染物以及反應(yīng)器設(shè)計(jì)的研究成果；Sullivan等[27]以甲基彎菌Methylosinus trichosporiumOB3b為模型菌株較詳細(xì)介紹了MMO的結(jié)構(gòu)、類別及其在降解污染方面的應(yīng)用潛力。以上綜述對(duì)了解氯代烴污染物生物降解的發(fā)展具有重要的指導(dǎo)價(jià)值，但有針對(duì)性地闡述甲烷氧化菌降解氯代烴還相對(duì)不足，尤其是氯代烴降解動(dòng)力學(xué)和兼性甲烷氧化菌降解氯代烴的綜述還未見(jiàn)報(bào)道。

據(jù)此，本文總結(jié)了國(guó)內(nèi)外相關(guān)的研究成果，并結(jié)合本課題組在甲烷氧化菌降解氯代烴方面的研究進(jìn)展，分析了純菌株和混合菌株對(duì)不同氯代烴的降解效果，考察了不同類型甲烷單加氧酶在不同底物體系中的活性表達(dá)和催化特性，總結(jié)了模型菌株M. trichosporiumOB3b降解氯代烴的動(dòng)力學(xué)特性，簡(jiǎn)述了兼性甲烷氧化菌降解氯代烴的特性及其應(yīng)用潛力，并淺析了所存在的問(wèn)題及未來(lái)的研究方向。

1 甲烷氧化菌和MMO降解氯代烴及降解動(dòng)力學(xué)研究

1.1 可降解氯代烴的甲烷氧化菌及其生物特性

1985年Wilson等[28]首次發(fā)現(xiàn)了富含甲烷氧化菌的土壤在天然氣刺激下能夠降解TCE，這打破了甲烷氧化菌只能利用甲烷的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)，并在一定程度上促進(jìn)了兼性甲烷氧化菌的發(fā)現(xiàn)。隨后的十幾年，研究者利用不同甲烷氧化菌對(duì)氯代烴降解進(jìn)行了探索，主要包括混合菌和純菌株，所研究的污染物也不再局限于某一種氯代物。1986年，F(xiàn)ogel等[29]利用由泥沙中分離的混合甲烷氧化菌對(duì)TCE等6種氯代烯烴的降解進(jìn)行了研究，利用同位素14C示蹤等方法證明了甲烷氧化菌能夠?qū)⒙却鸁N轉(zhuǎn)化為CO2并能利用其合成自身生物質(zhì)。1988年，Little等[30]利用僅以甲烷、乙醇為碳源的Ⅰ型甲烷氧化菌菌株46-1降解TCE并推測(cè)了其共代謝的降解機(jī)理及其降解產(chǎn)物。同年關(guān)于甲烷氧化菌降解氯代烴的第一個(gè)專利及隨后利用混合菌株在反應(yīng)器中降解鹵代烴的專利申請(qǐng)成功[31]。

此后，Janssen等[32]也在同一年對(duì)比了混合菌株與兩種純菌甲基單胞菌Methylomonas methanicaNCIB11130和M. trichosporiumOB3b對(duì)7種氯代烴的降解。研究發(fā)現(xiàn)分離的純菌與混合菌相比并無(wú)明顯差異，說(shuō)明氯代烴的降解只是甲烷氧化菌的作用。研究者也先后對(duì)甲基孢囊菌Methylocystissp. strain M降解TCE做了研究[33-35]，然而Uchiyama等[34]發(fā)現(xiàn)純化前的混合菌株MU-81與純菌株Methylocystissp. strain M對(duì)TCE的降解有明顯的區(qū)別 (混合菌株有時(shí)能將TCE全部降解，而純菌株不能)，進(jìn)一步分離發(fā)現(xiàn)了一種非自養(yǎng)菌strain DA4，進(jìn)而證明了該菌株在甲烷氧化菌降解氯代烴過(guò)程中起著重要的作用。以上研究表明混合菌中非甲烷氧化菌的種類繁多，而且這些菌在降解氯代烴過(guò)程中的作用有很大差異。

之前的大多數(shù)研究都停留在實(shí)驗(yàn)室層面，但環(huán)境中氯代烴污染存在污染范圍廣、面積不集中的特點(diǎn)[2,36-37]，這就對(duì)不改變環(huán)境條件、不轉(zhuǎn)移污染沉積物的原位生物修復(fù)技術(shù)提出了新的需求[25]。Semprini等[38]研究了含水土層中氯代烴的原位生物降解，發(fā)現(xiàn)灌注富含甲烷和氧氣的地下水可提高土著甲烷氧化菌活性，有效促進(jìn)氯代烴的降解。

1.2 MMO催化氯代烴降解的研究

兩種MMO如何催化氯代烴氧化及其活性的差異是長(zhǎng)期困擾研究者的問(wèn)題。研究表明，菌體生長(zhǎng)在高濃度銅離子條件下，MMO的還原型輔酶 (NADH) 會(huì)受到抑制，Ⅱ型甲烷氧化菌中的sMMO在較低濃度銅離子時(shí)才能表達(dá)[9,39]，而pMMO幾乎存在于所有的甲烷氧化菌中，但sMMO似乎比pMMO有更廣泛的特異性。大量關(guān)于sMMO的研究已經(jīng)通過(guò)M. trichosporiumOB3b展開，純sMMO比其他混合或純菌株對(duì)TCE的降解速率高出至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，這說(shuō)明它在生物降解領(lǐng)域中有較廣泛的應(yīng)用潛力[27]。

Anderson等[9]利用表達(dá)pMMO的混合甲烷氧化菌對(duì)氯乙烯 (Vinyl chloride, VC) 等5種氯代烯烴的降解做了研究，發(fā)現(xiàn)順-1,2-二氯乙烯(cis-1,2-Dichloroethylene, c-1,2-DCE) 、TCE和1,1-二氯乙烯 (1,1-Dichloroethylene, 1,1-DCE)的降解率遠(yuǎn)小于表達(dá)sMMO的菌株，但反-1,2-二氯乙烯 (trans-1,2-Dichloroethylene, c-1,2-DCE)和VC的降解量是所報(bào)道表達(dá)sMMO細(xì)胞的20倍，這說(shuō)明同一種酶對(duì)不同底物的親和力差別較大。Oldenhuis等[7]、Tsien等[40]、Fox等[41]和Jahng等[42]利用純菌株M. trichosporiumOB3b或由其純化的sMMO對(duì)TCE在內(nèi)的氯代烴進(jìn)行降解研究，結(jié)果都顯示氯代烴的降解是sMMO的作用，該酶的降解能力遠(yuǎn)高于其他能降解TCE的酶。

盡管sMMO對(duì)許多氯代烴有高效的催化氧化作用，但sMMO在氯代烴和甲烷之間強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)性抑制和smmo基因位點(diǎn)表達(dá)易受環(huán)境影響等原因限制了該類菌體的應(yīng)用。Jahng等[42]利用基因重組技術(shù)對(duì)重組菌株降解氯代烴做了研究，該菌株降解TCE過(guò)程不存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制，因而利用基因工程有望實(shí)現(xiàn)生物降解污染物的新突破。Lee等[43]發(fā)現(xiàn)表達(dá)pMMO甲烷氧化菌較sMMO菌株有更高的生長(zhǎng)速率，一些不同濃度氯代烴能影響 (促進(jìn)或抑制) 酶的活性和細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)都表明對(duì)于污染物的降解，MMO的結(jié)構(gòu)和菌體生長(zhǎng)的相對(duì)速率是重要的影響因素。

Phelps等[44]分離了一株能夠產(chǎn)生pMMO并能結(jié)構(gòu)性表達(dá)sMMO的M. trichosporiumOB3b變體菌株，其對(duì)TCE的降解速率是野生菌株的兩倍。Koh等[45]分離得到了第一個(gè)已知能表達(dá)sMMO的Ⅰ型甲烷氧化菌Methylomonas methanica68-1，該菌株能降解萘 (Naphthalene) 和TCE，其活性比相同條件下M. trichosporiumOB3b中的高，但對(duì)TCE的親和性小于M. trichosporiumOB3b (分別為(40±3) μmol/L和(126±8) μmol/L)，利用基因探針基因組示蹤和印跡雜交分析顯示兩種菌株內(nèi)的sMMO幾乎沒(méi)有同源性。以上研究表明sMMO在自然界中發(fā)展是多樣的。

sMMO催化氧化的范圍非常廣泛，包括烷烴的羥基化，烯烴、醚類、氯代烷烴的環(huán)氧化等[46-48]，但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，菌體降解范圍、菌株的生長(zhǎng)效率、生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物、酶的穩(wěn)定性及基因的表達(dá)規(guī)律等都是重要的影響因素。

1.3 氯代烴降解動(dòng)力學(xué)概述與模型菌株的降解動(dòng)力學(xué)分析

1.3.1 氯代烴降解動(dòng)力學(xué)概述

在確定了一些甲烷氧化菌能夠降解氯代烴后，研究者著手對(duì)其降解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究以實(shí)現(xiàn)氯代污染物的調(diào)控和生物降解。Strand等[49]在封閉的反應(yīng)器中研究了TCE、TCA降解動(dòng)力學(xué)。結(jié)果顯示兩種氯代烴濃度小于3 000 μg/L時(shí)，其降解均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)；通過(guò)提供底物(甲烷) 與否及改變氯代烴濃度所得結(jié)果證明該生物降解過(guò)程中底物之間存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制且動(dòng)力學(xué)研究存在一定的底物濃度范圍。

隨后Arvin[50]利用含有由氯代烴污染水體分離的混合甲烷氧化菌的生物膜反應(yīng)器探究了TCE等4種氯代烴的降解動(dòng)力學(xué)，當(dāng)氯代烴濃度在0?1.0 mg/L時(shí)，降解均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)；Broholm等[51]首次利用混合菌株提出并驗(yàn)證了底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制，以不同初始濃度的TCE(50?4 300 μg/L)和甲烷(0.53?3.2 mg/L)模擬了降解模型，該模型的建立為甲烷氧化菌降解TCE的研究及原位生物修復(fù)的工程設(shè)計(jì)提供了一定的理論指導(dǎo)。

由于在生長(zhǎng)底物和共代謝底物之間存在著競(jìng)爭(zhēng)性抑制，所以確定最適底物比例至關(guān)重要。Herbst[52]以TCE降解為例建立了生長(zhǎng)底物、共代謝底物和氯代物降解率之間的三維曲面 (圖1)。當(dāng)TCE濃度為7.5 mg/L時(shí)，最佳TCE的降解率處在較為狹小的區(qū)域，所以在降解研究過(guò)程中氯代烴的降解率通常較低。

圖1 TCE和底物濃度與其降解率的關(guān)系[31]Fig. 1 Dependence of the TCE degradation rate on substrate and co-metabolic substrate concentration[31].

1.3.2 菌株M. trichosporium OB3b降解氯代烴動(dòng)力學(xué)概述與分析

本文總結(jié)了模型菌株M. trichosporiumOB3b對(duì)多種氯代烴的降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如表1所示。Oldenhuis等[53]研究了M. trichosporiumOB3b對(duì)TCE等7種氯代烴的降解動(dòng)力學(xué)，結(jié)果表明CF、t-1,2-DCE和TCE為易降解化合物，1,2-二氯乙烷 (1,2-Dichloroethane, 1,2-DCA)、TCA和1,1-DCE為難降解化合物，說(shuō)明該菌株對(duì)不同氯代烴的親和性差異較大，并認(rèn)為sMMO與CF的親和性最大。

Van Hylckama等[12]利用自動(dòng)進(jìn)樣裝置研究了TCE和CF等8種氯代烴的降解動(dòng)力學(xué)常數(shù)，并取得了與Speitel等[11]一致的結(jié)果。TCE速率常數(shù)(0.5?3.31 mg/d) 是 CF(0.2?0.4 mg/d)的 2.5?11倍，并且甲烷存在時(shí)有嚴(yán)重的酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制存在，但有的研究結(jié)果顯示 CF的降解速率高于TCE[53-55]。出現(xiàn)以上情況可能是降解動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)分析和微生物培養(yǎng)條件的差異所造成的。

Fox等[41]通過(guò)額外添加生物酶研究了sMMO對(duì)氯代烴降解的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，結(jié)果顯示TCE等氯代烴的降解速率提高了4?5個(gè)數(shù)量級(jí)，通過(guò)添加合成生物酶能夠強(qiáng)化菌株在工程上的應(yīng)用。Aziz等[56]和Fitch等[57]利用M. trichosporiumOB3b的變種菌株M. trichosporiumOB3b PP358對(duì)單一和混合氯代烴的降解動(dòng)力學(xué)做了研究，該菌株對(duì)TCE等氯代烴的最大降解速率Vmax變化范圍為3.1?24.8 mg/(mgcell·d)，半飽和常數(shù)KS的變化范圍為1?10 mg/L。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)有些二元氯代烴混 合 物 如 TCE (0.3?0.5 mg/L)和 c-1,2-DCE(<5 mg/L)等在降解過(guò)程無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性抑制。自然環(huán)境下的污染物是非單一性，為了使菌體實(shí)現(xiàn)工程上的應(yīng)用，有必要建立合理的單一氯代烴，二元氯代烴甚至多元氯代烴降解動(dòng)力學(xué)模型。

不同氯代烴的動(dòng)力學(xué)常數(shù)相差較大，可以看出各氯代烴的半飽和速率常數(shù)KS，最高利用率Vmax和虛擬一階速率常數(shù)ka的變化范圍分別為0.34?28.6 mg/L ， 0.45?94.2 mg/(mgcell·d) 和0.16?11.52 L/(mg·d)。由于研究條件 (溫度、培養(yǎng)條件、氯代烴濃度等) 的差異，可能會(huì)導(dǎo)致某一氯代烴降解動(dòng)力學(xué)常數(shù)變化范圍較大，如CF的Vmax最大值是最小值的33.6倍，ka變化了77.7倍；TCE在濃度0.026 3?32.9 mg/L范圍內(nèi)，Vmax變化了120倍。在動(dòng)力學(xué)研究中，氯代烴的種類、結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)條件及菌株的類型等是重要的影響因素。

對(duì)比而言M. trichosporiumOB3b通常比混合菌的降解能力強(qiáng)。同時(shí)有研究表明氯化程度也影響氯代烴的相對(duì)速率常數(shù)，且隨著氯化程度的增加菌株對(duì)氯代烷烴和氯代烯的降解能力(速率常數(shù)) 呈逐漸遞減的趨勢(shì)，二氯甲烷(Dichloromethane, DCM) 和 VC的降解速率常數(shù)在同等條件下通常較大，這與Semprini等[38]的研究結(jié)論一致。氯代烷烴的生物降解速率與氯代烯烴相比有很大的不同，氯代烯烴的最大利用率高于氯代烷烴，并且氯代烯烴的最大利用率隨氯化程度的增加呈增大趨勢(shì)，這也說(shuō)明碳碳雙鍵比單鍵更容易被降解 (圖2)。

?

圖2 烴的氯化程度對(duì)一階速率常數(shù)Ka、最大利用率Vmax和半飽和常數(shù)Kc的影響Fig. 2 Impact of pseudo first-order rate constant, maximum utilization rate and half velocity constant on the extent of chlorinate. Where DCM, CF, 1,2-DCA and TCA are chloralkanes, and VC, 1,1-DCE, c-1,2-DCE, t-1,2-DCE and TCE are chloroalkenes.

2 兼性甲烷氧化菌降解氯代烴的研究進(jìn)展

通過(guò)降解動(dòng)力學(xué)能夠判斷污染物的降解是哪種MMO的作用，但是污染物與生長(zhǎng)底物之間存在著復(fù)雜的酶競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制。盡管甲烷氧化菌有廣泛的底物降解范圍，但是甲烷在水溶液中的微溶性使得甲烷氧化菌作為介質(zhì)的生物修復(fù)實(shí)現(xiàn)有了一定的難度。研究發(fā)現(xiàn)一些兼性甲烷氧化菌能利用多種碳源表達(dá)MMO，例如甲基細(xì)胞菌屬M(fèi)ethylocella兼性甲烷氧化菌能優(yōu)先利用乙酸、丙酮酸、琥珀酸、蘋果酸和乙醇等多碳化合物。這就使得在沒(méi)有甲烷的條件下，利用甲烷氧化菌降解污染物成為了可能，從而有望克服MMO的底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

2.1 兼性甲烷氧化菌Methylocystis strain SB2降解氯代烴的研究現(xiàn)狀

近幾年來(lái)研究者們研究最多為變形菌綱(α-Proteobacteria) 兼 性 甲 烷 氧 化 菌Methylocystisstrain SB2，研究發(fā)現(xiàn)它能夠結(jié)構(gòu)性表達(dá)MMO，并且能夠在乙酸或乙醇為底物的培養(yǎng)基中降解多種氯代烴類污染物[58-59]。Im等[58]利用不同底物 (甲烷和乙醇) 存在時(shí)該菌株降解氯代烴的結(jié)果表明氯代烴降解過(guò)程不影響該菌株生長(zhǎng)，該降解過(guò)程是由于pMMO的作用，pMMO的競(jìng)爭(zhēng)性抑制限制了菌株的生長(zhǎng)和氯代烴的降解，且不同氯代烴的降解機(jī)理不同。

隨后Yoon等[59]首先利用PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 技術(shù)證明在乙酸鹽中pmoA的表達(dá)比在甲烷中減少了1?2個(gè)數(shù)量級(jí)，利用Methylocystisstrain SB2降解TCE等3種氯代烴的研究同樣得到了Im等的結(jié)論。Jagadevan等[10]基于Methylocystisstrain SB2降解氯代烴的研究得到了兩點(diǎn)重要的結(jié)論：1)Methylocystisstrain SB2在乙醇中生長(zhǎng)時(shí)pMMO為非必需酶，乙醇能夠作為一種選擇性生長(zhǎng)基質(zhì)促進(jìn)污染物的降解；2)Methylocystisstrain SB2能夠利用乙醇增強(qiáng)污染物的轉(zhuǎn)移和降解。

2.2 兼性甲烷氧化菌 Methylomicrobium album BG8降解氯代烴的研究現(xiàn)狀

20世紀(jì)末，Han等[60-61]、和Lontoh等[6]對(duì)甲基微菌MethylomicrobiumalbumBG8降解氯代烴做了較為系統(tǒng)的研究，通過(guò)同位素示蹤法對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，針對(duì)降解過(guò)程探究了氯代烴的降解動(dòng)力學(xué)。Han等[60]根據(jù)氯代烴降解程度及對(duì)菌體的毒性作用將其分為4類：1) 能夠被降解對(duì)菌體毒性小；2) 能夠被降解有強(qiáng)烈的毒性作用；3) 不能被降解對(duì)菌體毒性??；4) 不能被降解有強(qiáng)烈的毒性作用。Oldenhuis等[53]詳細(xì)研究了TCE對(duì)細(xì)胞毒性作用，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的失活程度與TCE的降解量成正比，并證實(shí)細(xì)胞失活是由于降解產(chǎn)物與細(xì)胞蛋白質(zhì)共價(jià)鍵的非特異性結(jié)合。Han等[61]研究表明一氯甲烷 (Chloromethane)能夠作為該菌體碳源促進(jìn)其在甲醇中生長(zhǎng)，并得到其表觀速率常數(shù)ka和最大降解率Vmax分別為(11±3) μmol/L 和 (15±0.6) nmol/(mgcell·min)。Lontoh等[6]將莢膜甲基球菌MethylococcuscapsulatusBath中純化的pMMO用于TCE降解研究，結(jié)果表明TCE能被pMMO降解為CO2，通過(guò)乙炔致失活原理證明MethylomicrobiumalbumBG8中pMMO是氯代物氧化的活性物，并提出了TCE降解途徑：TCE首先轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化合物，而后通過(guò)自發(fā)化學(xué)反應(yīng)釋放HCl變?yōu)橐胰┧猁}，其在pMMO的作用下氧化為甲酸鹽和二氧化碳。圖3為Alvarez-Cohen等[55]提出的MMO催化氧化CF和TCE過(guò)程。

2.3 礦化垃圾中兼性甲烷氧化菌篩選與氯代烴耐受性研究

2009年，Zhao等[62]分離得到了一株兼性甲烷氧化菌Methylocystisstrain JTA1。它能提高礦化垃圾生物覆蓋層甲烷氧化能力，也對(duì)TCE、CF等氯代烴具有較高耐受性。由圖4可知，在低濃度CF (20?50 mg/L)條件下，菌株顯示了較高的甲烷氧化活性；此外，與活性細(xì)胞 (Growing cell) 相比，菌株JTA1的靜息細(xì)胞 (Resting cell)對(duì)TCE和CF有更強(qiáng)的降解活性[62]，這與M. trichosporiumOB3b在靜息細(xì)胞狀態(tài)下能夠完全降解CF[41]的結(jié)果一致。同時(shí)，利用由礦化垃圾中富集的甲烷氧化菌群研究了其靜息細(xì)胞對(duì)TCE的共代謝降解，以Monod模型為基礎(chǔ)進(jìn)行了降解動(dòng)力學(xué)推演[63]，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)TCE初始濃度為45.5 mg/L，菌體濃度Cx為1.728 g/L時(shí)，降解率為79%。降解TCE的動(dòng)力學(xué)符合Monod模型。通過(guò)擬合得到最大比消耗速率qs,max為1.51×10–4min–1、半 飽 和 常數(shù)KS為2.58 mg/L(R2=0.961)。KS小于M. trichosporiumOB3b，說(shuō)明該菌群對(duì)TCE有較強(qiáng)的親和力。以上研究有效的擴(kuò)展了兼性甲烷氧化菌的應(yīng)用領(lǐng)域，開展基于兼性甲烷氧化菌的深入系統(tǒng)研究，有望在氯代烴生物降解的工程應(yīng)用領(lǐng)域取得新的突破。

圖3 MMO催化降解TCE和CF過(guò)程[55]Fig. 3 The process of degradation of TCE and CF by MMO[55].

圖4 Methylocystis strain JTA1對(duì)不同濃度CF的耐受性[62]Fig. 4 Chloroform tolerance of Methylocystis strain JTA1 at different concentrations of chloroform[62].

2.4 兼性甲烷氧化菌中pMMO的催化特性及其應(yīng)用潛力

pMMO和sMMO不僅在細(xì)胞中存在方式不同，而且它們對(duì)抑制劑的敏感程度也有差別，pMMO包含有更多敏感的酶[64]。與sMMO相比pMMO的底物范圍較小，降解速度較慢，所以早期的研究主要針對(duì)表達(dá)sMMO的細(xì)胞且多數(shù)只有一種甲烷氧化菌和單一污染物的簡(jiǎn)單系統(tǒng)。在復(fù)雜原位自然環(huán)境下，表達(dá)pMMO的菌株在普遍化氯乙烯類污染物中更容易存活[43]，并且能夠氧化除環(huán)狀和芳香烴外長(zhǎng)度高達(dá)5個(gè)碳原子以上的烷烴和烯烴[27,46,65]，有研究顯示pMMO對(duì)碳的利用率比sMMO高38%[66]，這表明在利用表達(dá)pMMO的兼性甲烷氧化菌降解氯代物時(shí)有了較為廣泛的碳源，同時(shí)通過(guò)添加像乙醇類的多碳化合物克服由于甲烷的微溶性對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響也成為了可能，這使得越來(lái)越多的研究逐漸青睞于pMMO。研究者們利用乙醇原位注入到被TCE和四氯乙烯污染的水中強(qiáng)化甲烷氧化菌對(duì)污染物的降解，并驗(yàn)證了其可行性[67-68]。Lee等[43]和Yoon等[69]利用“△模型”預(yù)測(cè)了sMMO和pMMO的表達(dá)，結(jié)果顯示表達(dá)pMMO的甲烷氧化菌選擇的氯代烴濃度范圍超過(guò)sMMO的細(xì)胞。所以能夠利用多碳化合物的兼性甲烷氧化菌比專一甲烷氧化菌在降解氯代烴上有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

圖5 甲烷氧化菌群對(duì)TCE降解曲線和以Monod方程為基礎(chǔ)的降解動(dòng)力學(xué)擬合[63]Fig. 5 Degradation curve of TCE by methanotrophs and degradation kinetics of TCE based on Monod equation[63].Where Cx, rsL and CS are dry weight of the strain, average degradation rate of TCE in the interval time of measure and concentrations of TCE respectively.

兼性甲烷氧化菌降解污染物時(shí)能夠合成自身的生物質(zhì)。早期的研究中沒(méi)有對(duì)這種現(xiàn)象給出一個(gè)較為合理的解釋，研究中發(fā)現(xiàn)，在甲醇為底物的培養(yǎng)基中一氯甲烷能夠刺激甲烷氧化菌的生長(zhǎng)[28]。但兼性甲烷氧化菌同化多碳化合物的途徑仍然是不清楚的，迄今為止所有已確認(rèn)的兼性甲烷氧化菌都是α-Proteobacteria，都是通過(guò)絲氨酸途徑從甲醛中對(duì)碳同化，氧化乙酸鹽過(guò)程產(chǎn)生的蘋果酸和乙醛酸鹽是絲氨酸循環(huán)的中間體[8,41]，且乙醛酸鹽是表達(dá)pMMO的細(xì)胞和純sMMO氧化TCE的初級(jí)產(chǎn)物[25]，這表明，兼性甲烷氧化菌和甲烷氧化菌利用絲氨酸循環(huán)進(jìn)行碳同化作用。

3 甲烷氧化菌降解氯代烴現(xiàn)存問(wèn)題及未來(lái)發(fā)展方向

近20年來(lái)，利用甲烷氧化菌在氯代烴類污染物生物降解中的應(yīng)用取得了許多實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，這主要包括反應(yīng)器規(guī)模的氯代烴類污染物生物修復(fù)[14,57,70-78]和原位實(shí)地污染物的生物移除[13,38,79-81]。生物反應(yīng)器分為基質(zhì)、菌體生長(zhǎng)及污染物的降解發(fā)生在同一空間的單級(jí)反應(yīng)器和菌體生長(zhǎng)與污染物降解發(fā)生在不同位置的多級(jí)反應(yīng)器。多級(jí)反應(yīng)器的最大優(yōu)勢(shì)是避免了生長(zhǎng)基質(zhì)和污染物之間對(duì)MMO的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，從而提高了污染物的降解能力。原位生物修復(fù)的關(guān)鍵步驟是通過(guò)添加安全廉價(jià)的碳源、氮源等對(duì)本土甲烷氧化菌的生物刺激從而增強(qiáng)其對(duì)污染物的共代謝降解能力。該研究在土壤和廢水污染物的生物移除等領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用潛力和實(shí)用價(jià)值。

盡管甲烷氧化菌在氯代污染物的生物降解方面展示了廣泛的應(yīng)用前景，但能夠降解氯代污染物且較易控制生物活動(dòng)的甲烷氧化菌菌株的數(shù)量較少，在分子水平上對(duì)甲烷氧化菌的研究還并不完善。另外，由于專一營(yíng)養(yǎng)甲烷氧化菌僅能以甲烷或甲基化合物為碳源，這就使得菌體富集和擴(kuò)大培養(yǎng)手段難于在工程上應(yīng)用。而兼性甲烷氧化菌降解氯代烴過(guò)程存在著生長(zhǎng)底物和氯代烴、氯代污染物之間的競(jìng)爭(zhēng)抑制[49,55-56]，污染物及共代謝產(chǎn)物的毒性也會(huì)引起菌體活性及轉(zhuǎn)化效率的降低[41,82]。

未來(lái)研究中，首先應(yīng)廣泛地利用高通量測(cè)序和宏基因組分析等先進(jìn)的基因工程手段確定兼性甲烷氧化菌在不同地域的豐度和分布。目前，兼性甲烷氧化菌的研究才剛剛起步，國(guó)內(nèi)外公開的兼性甲烷氧化菌株還不超過(guò)10個(gè)[8,83]，更多新菌的分離純化和生物特性都亟待研究。其次，應(yīng)更深入地開展氯代烴降解的動(dòng)力學(xué)研究，包括菌體細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、氯代烴降解動(dòng)力學(xué)和共代謝底物抑制動(dòng)力學(xué)等，通過(guò)推演動(dòng)力學(xué)參數(shù)，揭示氯代烴以及其他氯代有機(jī)污染物的降解機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，開發(fā)新型生物反應(yīng)器和菌株的擴(kuò)培強(qiáng)化也是保證工程應(yīng)用的關(guān)鍵。這些研究不僅能夠促進(jìn)甲烷氧化菌在污染物降解領(lǐng)域的應(yīng)用，而且還能指導(dǎo)其他降解氯代烴污染物的甲基營(yíng)養(yǎng)菌研究。相關(guān)研究成果也將成為甲烷氧化菌工程應(yīng)用的重要理論和工藝基礎(chǔ)。

[1]Nizzetto L, Macleod M, Borg? K, et al. Past,present, and future controls on levels of persistent organic pollutants in the global environment.Environ Sci Technol, 2010, 44(17)： 6526–6531.

[2]Yuan D, Yang D, Wade TL, et al. Status of persistent organic pollutants in the sediment from several estuaries in China. Environ Pollut, 2001,114(1)： 101–111.

[3]Cappelletti M, Frascari D, Zannoni D, et al.Microbial degradation of chloroform. Appl MicrobiolBiotechnol, 2012, 96(6)： 1395–1409.

[4]DiSpirito AA, Gulledge J, Shiemke AK, et al.Trichloroethylene oxidation by the membrane-associated methane monooxygenase in type I, type II and type X methanotrophs.Biodegradation, 1991, 2(3)： 151–164.

[5]Lontoh S, Semrau JD. Methane and trichloroethylene degradation byMethylosinus trichosporiumOB3b expressing particulate methane monooxygenase. Appl Environ Microbiol,1998, 64(3)： 1106–1114.

[6]Lontoh S, Zahn JA, DiSpirito AA, et al.Identification of intermediates ofin vivotrichloroethylene oxidation by the membrane-associated methane monooxygenase.FEMS Microbiol Lett, 2000, 186(1)： 109–113.

[7]Oldenhuis R, Vink R, Janssen DB, et al.Degradation of chlorinated aliphatic hydrocarbons byMethylosinus trichosporiumOB3b expressing soluble methane monooxygenase. Appl Environ Microbiol, 1989, 55(11)： 2819–2826.

[8]Semrau JD, DiSpirito AA, Vuilleumier S.Facultative methanotrophy： false leads, true results,and suggestions for future research. FEMS Microbiol Lett, 2011, 323(1)： 1–12.

[9]Anderson JE, McCarty PL. Transformation yields of chlorinated ethenes by a methanotrophic mixed culture expressing particulate methane monooxygenase. Appl Environ Microbiol, 1997,63(2)： 687–693.

[10]Jagadevan S, Semrau JD. Priority pollutant degradation by the facultative methanotroph,Methylocystis strain SB2. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(11)： 5089–5096.

[11]Speitel Jr GE, Thompson RC, Weissman D.Biodegradation kinetics ofMethylosinus trichosporiumOB3b at low concentrations of chloroform in the presence and absence of enzyme competition by methane. Water Res, 1993, 27(1)：15–24.

[12]Van Hylckama VJ, De Koning W, Janssen DB.Transformation kinetics of chlorinated ethenes byMethylosinus trichosporiumOB3b and detection of unstable epoxides by on-line gas chromatography.Appl Microbiol Biotechnol, 1996, 62(9)： 3304–3312.

[13]Brockman F, Payne W, Workman D, et al. Effect of gaseous nitrogen and phosphorus injection onin situbioremediation of a trichloroethylene-contaminated site. J Hazard Mater, 1995, 41(2)： 287–298.

[14]Kumar A, Vercruyssen A, Dewulf J, et al. Removal of gaseous trichloroethylene (TCE) in a composite membrane biofilm reactor. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng, 2012, 47(7)：1046–1052.

[15]Dedysh SN, Knief C, Dunfield PF.Methylocellaspecies are facultatively methanotrophic. J Bacteriol, 2005, 187(13)： 4665–4670.

[16]Lee JH, Kim TG, Cho KS. Isolation and characterization of a facultative methanotroph degrading malodor-causing volatile sulfur compounds. J Hazard Mater, 2012, 235： 224–229.

[17]Belova SE, Baani M, Suzina NE, et al. Acetate utilization as a survival strategy of peat-inhabitingMethylocystisspp.. Environ Microbiol Rep, 2011,3(1)： 36–46.

[18]Dedysh SN, Panikov NS, Liesack W, et al.Isolation of acidophilic methane-oxidizing bacteria from northern peat wetlands. Science, 1998,282(5387)： 281–284.

[19]Dunfield PF.Methylocella silvestrissp. nov., a novel methanotroph isolated from an acidic forest cambisol. Int J Syst Evol Microbiol, 2003, 53(5)：1231–1239.

[20]Zhao TT, Xing ZL, Zhang LJ. Research progress and discovery process of facultative methanotrophs—a review. Acta Microbiol Sin,2013, 53(8)： 781–789 (in Chinese).

趙天濤, 邢志林, 張麗杰. 兼性甲烷氧化菌的發(fā)現(xiàn)歷程. 微生物學(xué)報(bào), 2013, 53(8)： 781–789.

[21]Han B, Su T, Li X, et al. Research progresses of methanotrophs and methane monooxygenase. Chin J Biotech, 2008, 24(9)： 1511–1519 (in Chinese).

韓冰, 蘇濤, 李信, 等. 甲烷氧化菌及甲烷單加氧酶的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2008, 24(9)：1511–1519.

[22]Wei SZ. Methanotrophs and their applications in environment treatment： a review. Chin J Appl Ecol,2012, 23(8)： 2309–2318 (in Chinese).

魏素珍. 甲烷氧化菌及其在環(huán)境治理中的應(yīng)用.中國(guó)應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2012, 23(8)： 2309–2318.

[23]Bao LJ, Zhang YB, Wu HZ, et al. Research progress of biodegradation of halogenated organic compound. Chin J Health Lab Technol, 2002,12(3)： 376–380 (in Chinese).

鮑倫軍, 張遠(yuǎn)標(biāo), 吳宏中, 等. 鹵代有機(jī)物生物降解研究進(jìn)展. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2002, 12(3)：376–380.

[24]Jiang H, Chen Y, Jiang P, et al. Methanotrophs：Multifunctional bacteria with promising applications in environmental bioengineering.Biochem Eng J, 2010, 49(3)： 277–288.

[25]Brigmon RL. Methanotrophic bacteria： use in bioremediation. Encyclopedia Environ Microbl,2001： 1936–1944.

[26]Semrau JD. Bioremediation via methanotrophy：overview of recent findings and suggestions for future research. Front Microbiol, 2011, 2(209)：1–7.

[27]Sullivan JP, Dickinson D, Chase HA.Methanotrophs,Methylosinus trichosporiumOB3b,sMMO, and their application to bioremediation.Crit Rev Microbiol, 1998, 24(4)： 335–373.

[28]Wilson JT, Wilson BH. Biotransformation of trichloroethylene in soil. Appl Environ Microbiol,1985, 49(1)： 242–243.

[29]Fogel MM, Taddeo AR, Fogel S. Biodegradation of chlorinated ethenes by a methane-utilizing mixed culture. Appl Environ Microbiol, 1986, 51(4)：720–724.

[30]Little CD, Palumbo AV, Herbes SE, et al.Trichloroethylene biodegradation by a methane-oxidizing bacterium. Appl Environ Microbiol, 1988, 54(4)： 951–956.

[31]Wendlandt KD, Stottmeister U, Helm J, et al. The potential of methane-oxidizing bacteria for applications in environmental biotechnology. Eng Life Sci, 2010, 10(2)： 87–102.

[32]Janssen DB, Grobben G, Hoekstra R, et al.Degradation of trans-1,2-dichloroethene by mixed and pure cultures of methanotrophic bacteria. Appl MicrobiolBiotechnol, 1988, 29(4)： 392–399.

[33]Nakajima T, Hiroo UI, Yagi TO, et al. Purif i cation and properties of a soluble methane monooxygenase fromMethylocystissp. M. Biosci Biotech Biochem, 1992, 56(5)： 736–740.

[34]Uchiyama H, Nakajima T, Yagi O, et al. Role of heterotrophic bacteria in complete mineralization of trichloroethylene byMethylocystissp. strain M.Appl Environ Microbiol, 1992, 58(9)： 3067–3071.

[35]Uchiyama H, Nakajima T, Yagi O, et al. Aerobic degradation of trichloroethylene by a new type II methane-utilizing bacterium, strain M. Agric Biol Chem, 1989, 53(11)： 2903–2907.

[36]Chen CB, Yang Q, Shen ZL. Research progress of bioremediation of TCE in underground water. J East Chin Geo Ins, 2003, 26(1)： 10–14 (in Chinese).

陳翠柏, 楊琦, 沈照理. 地下水三氯乙烯 (TCE)生物修復(fù)的研究進(jìn)展. 華東地質(zhì)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003,26(1)： 10–14.

[37]Wei CH, Zhang XX, Ren Y, et al. Pollution control of persistent organic pollutants, in water system：adsorption/enrichment, biodegradation and process analysis. Environ Chem, 2011, 30(1)： 300–309 (in Chinese).

韋朝海, 張小璇, 任源, 等. 持久性有機(jī)污染物的水污染控制： 吸附富集, 生物降解與過(guò)程分析.環(huán)境化學(xué), 2011, 30(1)： 300–309.

[38]Semprini L, Roberts PV, Hopkins GD, et al. A field evaluation ofin-situbiodegradation of chlorinated ethenes： part 2, results of biostimulation and biotransformation experiments. Groundwater, 1990,28(5)： 715–727.

[39]Alvarez-Cohen L, McCarty P, Boulygina E, et al.Characterization of a methane-utilizing bacterium from a bacterial consortium that rapidly degrades trichloroethylene and chloroform. Appl Environ Microbiol, 1992, 58(6)： 1886–1893.

[40]Tsien HC, Brusseau GA, Hanson RS, et al.Biodegradation of trichloroethylene byMethylosinus trichosporiumOB3b. Appl Environ Microbiol, 1989, 55(12)： 3155–3161.

[41]Fox BG, Borneman JG, Wackett LP, et al.Haloalkene oxidation by the soluble methane monooxygenase fromMethylosinus trichosporiumOB3b： mechanistic and environmental implications.Biochemistry, 1990, 29(27)： 6419–6427.

[42]Jahng D, Wood TK. Trichloroethylene and chloroform degradation by a recombinant pseudomonad expressing soluble methane monooxygenase fromMethylosinus trichosporiumOB3b. Appl Environ Microbiol, 1994, 60(7)：2473–2482.

[43]Lee SW, Keeney DR, Lim DH, et al. Mixed pollutant degradation byMethylosinus trichosporiumOB3b expressing either soluble or particulate methane monooxygenase： can the tortoise beat the hare? Appl Environ Microbiol,2006, 72(12)： 7503–7509.

[44]Phelps PA, Agarwal SK, Speitel GE, et al.Methylosinus trichosporiumOB3b mutants having constitutive expression of soluble methane monooxygenase in the presence of high levels of copper. Appl Environ Microbiol, 1992, 58(11)：3701–3708.

[45]Koh SC, Bowman JP, Sayler GS. Soluble methane monooxygenase production and trichloroethylene degradation by a type I methanotroph,Methylomonasmethanica 68-1. Appl Environ Microbiol, 1993, 59(4)： 960–967.

[46]Brusseau GA, Tsien HC, Hanson RS, et al.Optimization of trichloroethylene oxidation by methanotrophs and the use of a colorimetric assay to detect soluble methane monooxygenase activity.Biodegradation, 1990, 1(1)： 19–29.

[47]Nazaries L, Murrell JC, Millard P, et al. Methane,microbes and models： fundamental understanding of the soil methane cycle for future predictions.Environ Microbiol, 2013, 15(9)： 2395–2417.

[48]Green J, Dalton H. Protein B of soluble methane monooxygenase fromMethylococcus capsulatus(Bath). A novel regulatory protein of enzyme activity. J Biol Chem, 1985, 260(29)： 15795–15801.

[49]Strand S, Bjelland M, Stensel H. Kinetics of chlorinated hydrocarbon degradation by suspended cultures of methane-oxidizing bacteria. J Water Pollut Control Fed, 1990, 62(2)： 124–129.

[50]Arvin E. Biodegradation kinetics of chlorinated aliphatic hydrocarbons with methane oxidizing bacteria in an aerobic fixed biofilm reactor. Water Res, 1991, 25(7)： 873–881.

[51]Broholm K, Christensen TH, Jensen BK. Modelling TCE degradation by a mixed culture of methane-oxidizing bacteria. Water Res, 1992,26(9)： 1177–1185.

[52]Herbst B. Biologischer Abbau von dichlormethan und dichlorethan durch mischkulturen im wirbelschichtreaktor. Ph.D. Berlin： TU Berlin, 1995.

[53]Oldenhuis R, Oedzes JY, Vander WJ, et al.Kinetics of chlorinated hydrocarbon degradation byMethylosinus trichosporiumOB3b and toxicity of trichloroethylene. Appl Environ Microbiol, 1991,57(1)： 7–14.

[54]Kim J, Lee WB. The development of a prediction model for the kinetic constant of chlorinated aliphatic hydrocarbons. Environ Model Assess,2007, 14(1)： 93–100.

[55]Alvarez-Cohen L, Mccarty PL. Product toxicity and cometabolic competitive inhibition modeling of chloroform and trichloroethylene transformation by methanotrophic resting cells. Appl Environ Microbiol, 1991, 57(4)： 1031–1037.

[56]Aziz C, Georgiou G, Speitel G. Cometabolism of chlorinated solvents and binary chlorinated solvent mixtures usingM. trichosporiumOB3b PP358.Biotechnol Bioeng, 1999, 65(1)： 100–107.

[57]Fitch MW, Weissman D, Phelps P, et al.Trichloroethylene degradation byMethylosinus trichosporiumOB3b mutants in a sequencing biofilm reactor. Water Res, 1996, 30(11)：2655–2664.

[58]Im J, Semrau JD. Pollutant degradation by aMethylocystisstrain SB2 grown on ethanol：bioremediation via facultative methanotrophy.FEMS Microbiol Lett, 2011, 318(2)： 137–142.

[59]Yoon S, Im J, Bandow N, et al. Constitutive expression of pMMO byMethylocystisstrain SB2 when grown on multi-carbon substrates： implications for biodegradation of chlorinated ethenes. Environ Microbiol Rep, 2011, 3(2)： 182–188.

[60]Han JI, Lontoh S, Semrau JD. Degradation of chlorinated and brominated hydrocarbons byMethylomicrobiumalbumBG8. Arch Microbiol,1999, 172(6)： 393–400.

[61]Han JI, Semrau JD. Chloromethane stimulates growth ofMethylomicrobium albumBG8 on methanol. FEMS Microbiol Lett, 2000, 187(1)：77–81.

[62]Zhao TT, Zhang L, Zhang Y, et al. Characterization ofMethylocystisstrain JTA1 isolated from aged refuse and its tolerance to chloroform. J Environ Sci (China), 2013, 25(4)： 770–775.

[63]Zhang LJ, Hu QM, Xing ZL, et al. Study on kinetics of co-metabolism degradation of TCE by methanotrophs community, J Chongqing Univ Technol： Nat Sci Ed, 2013, 10(27)： 30–35 (in Chinese).

張麗杰, 胡慶梅, 邢志林, 等. 甲烷氧化菌群共代謝降解 TCE的動(dòng)力學(xué)研究. 重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版, 2013, 10(27)： 30–35.

[64]Stanley S, Prior S, Leak D, et al. Copper stress underlies the fundamental change in intracellular location of methane mono-oxygenase in methane-oxidizing organisms： studies in batch and continuous cultures. Biotechnol Lett, 1983, 5(7)：487–492.

[65]Burrows KJ, Cornish A, Scott D, et al. Substrate specificities of the soluble and particulate methane mono-oxygenases ofMethylosinus trichosporiumOB3b. J Gen Microbiol, 1984, 130(12)： 3327–3333.

[66]Leak DJ, Dalton H. Growth yields of methanotrophs. Appl Microbiol Biotechnol, 1986,23(6)： 470–476.

[67]Ramakrishnan V, Ogram AV, Lindner AS. Impacts of co-solvent flushing on microbial populations capable of degrading trichloroethylene. Environ Health Perspect, 2005, 113(1)： 55–61.

[68]Taylor TP, Rathfelder KM, Pennell KD, et al.Effects of ethanol addition on micellar solubilization and plume migration during surfactant enhanced recovery of tetrachloroethene.J Contam Hydrol, 2004, 69(1)： 73–99.

[69]Yoon S, Semrau JD. Measurement and modeling of multiple substrate oxidation by methanotrophs at 20 ℃. FEMS Microbiol Lett, 2008, 287(2)： 156–162.

[70]Sang NN, Soda S, Ishigaki T, et al. Microorganisms in landfill bioreactors for accelerated stabilization of solid wastes. J Biosci Bioeng, 2012, 114(3)：243–250.

[71]Limbri H, Gunawan C, Rosche B, et al. Challenges to developing methane biofiltration for coal mine ventilation air： a review. Water Air Soil Pollut,2013, 224(6)： 1–15.

[72]Shimomura T, Suda F, Uchiyama H, et al.Biodegradation of trichloroethylene byMethylocystissp. strain M immobilized in gel beads in a fluidized-bed bioreactor. Water Res, 1997,31(9)： 2383–2386.

[73]Speitel GE, Leonard JM. A sequencing biofilm reactor for the treatment of chlorinated solvents using methanotrophs. Water Environ Res, 1992,64(5)： 712–719.

[74]Skouteris G, Hermosilla D, López P, et al.Anaerobic membrane bioreactors for wastewater treatment： a review. Chem Eng J, 2012, 198-199：138–148.

[75]Strand SE, Wodrich JV, Stensel HD.Biodegradation of chlorinated solvents in a sparged, methanotrophic biofilm reactor. J Water Pollut Control Fed, 1991, 63(6)： 859–867.

[76]Fernandez FE, Pinho I, Carballa M, et al.Biodegradation kinetic constants and sorption coefficients of micropollutants in membrane bioreactors. Biodegradation, 2013, 24(2)： 1–13.

[77]Walter GA, Strand SE, Herwig RP, et al.Trichloroethylene and methane feeding strategies to sustain degradation by methanotrophic enrichments.Water Environ Res, 1997, 69(6)： 1066–1074.

[78]Yu Y. Application of a methanotrophic immobilized soil bioreactor to trichloroethylene degradation[D].Kingston： Queen’s University, 2008.

[79]Eguchi M, Kitagawa M, Suzuki Y, et al. A field evaluation of in situ biodegradation of trichloroethylene through methane injection. Water Res, 2001, 35(9)： 2145–2152.

[80]Suttinun O, Luepromchai E, Müller R.Cometabolism of trichloroethylene： concepts,limitations and available strategies for sustained biodegradation. Rev Environ Sci Biotechnol, 2013,12(1)： 1–16.

[81]Braeckevelt M, Fischer AK?stner M. Field applicability of Compound-Specific Isotope Analysis(CSIA) for characterization and quantification of in situ contaminant degradation in aquifers. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 94(6)： 1401–1421.

[82]Green J, Dalton H. Substrate specificity of soluble methane monooxygenase. Mechanistic implications.J Biol Chem, 1989, 264(30)： 17698–17703.

[83]Theisen AR, Murrell JC. Facultative methanotrophs revisited. J Bacteriol, 2005, 187(13)： 4303–4305.