穩(wěn)定遺傳的染色體組合整合釀酒酵母重組菌株的構建

左頎，趙心清，劉海軍，胡世洋，馬中義，白鳳武

1 大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116023 2 中國石油天然氣股份有限公司 吉林石化公司研究院，吉林 吉林 132021

釀酒酵母廣泛應用于食品、釀造和燃料乙醇生產等領域，對其進行遺傳育種研究一直是國內外研究的熱點。染色體整合表達可實現(xiàn)基因工程菌的穩(wěn)定遺傳。目前利用同源重組構建穩(wěn)定表達的釀酒酵母菌株已被廣泛研究，選取的整合位點包括rDNA位點[1]和 δ-序列位點[2]等多拷貝整合位點，以及URA3[3]、HO[4]位點等單拷貝整合位點。對β-半乳糖苷酶報告基因在釀酒酵母染色體上多個位點整合結果的研究表明，lacZ基因在不同位點整合后，酶活差異可達到8.7倍[5]，推測可能存在位置效應，即由于染色體組蛋白甲基化等表觀遺傳學效應導致基因在染色體的不同位置表達水平不同[6-7]。

隨著代謝工程的不斷發(fā)展，微生物的遺傳改造常需要對多個基因進行操作，在多基因整合時受抗生素和營養(yǎng)缺陷型選擇標記種類的限制。Cre/loxP和 FLP/FRT重組系統(tǒng)因其可去除抗生素標記基因而被廣泛應用于菌株的同源重組[8-9]。雖然這兩個系統(tǒng)有著非常高效的重組效率，但是重組酶識別位點loxP和FRT序列仍然留在基因組上，可能會引發(fā)新的同源重組[9]。因此，選擇可以徹底去除抗生素標記基因，并且可多次循環(huán)使用的高效重組載體，對酵母菌的生物育種非常關鍵。在代謝途徑中限速步驟往往由多個基因控制，因此代謝工程操作需要對多個基因的表達進行平衡調控。國外學者采用多基因啟動子改組 (Multiple gene-promoter shuffling，MGPS) 方法[10]，將不同活性的啟動子與關鍵酶基因進行組合，從而調控多基因表達水平的平衡。但研究多基因在染色體不同位點的組合整合對基因表達和代謝的影響還沒有相關報道。

pAUR135載體是可以循環(huán)使用抗生素標記的載體，該載體帶有GIN11M86基因，可在Gal10啟動子和半乳糖誘導下過量表達，只保留經過同源重組的不帶有任何外源序列的轉化子，利用該載體可對釀酒酵母進行重復多次整合表達，但國內相關的研究目前還沒有充分開展。酵母菌代謝工程改造常需要多個基因的操作，多基因的表達需要進行平衡匹配，才能達到較好的效果[11]。我們以木糖代謝途徑改造為例，說明了染色體組合整合表達方法構建工業(yè)釀酒酵母菌的過程，該方法也可用于其他代謝途徑基因的改造，所獲得的工程菌株不帶有任何外來基因和選擇標記，可穩(wěn)定遺傳，為工業(yè)釀酒酵母的分子育種提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

XR和XDH基因供體為樹干畢赤酵母Scheffersomyces stipitisJCM 10742 (日本 RIKEN BioResource Center)，XK基因供體為S288c (本實驗室保存)。工業(yè)釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae6525為本實驗室保存。克隆載體pUC18和酵母pAUR135載體購自大連寶生物公司。釀酒酵母培養(yǎng)使用YPD培養(yǎng)基。按照實驗需要，加入終濃度為2.5 μg/mL金擔子素 (aureobasidin A，簡稱Aba+) 進行酵母陽性克隆子篩選。

1.2 分子克隆所用酶及試劑盒

PCR所用 Phusion High-Fidelity DNA聚合酶和限制性內切酶購自NEB公司。T4 DNA連接酶購自Fermentas公司。DNA片段純化與回收試劑盒購自Omega Bio-tek, Inc.。

1.3 基因克隆和載體構建

1.3.1 染色體組合整合木糖途徑基因盒的擴增和構建

以S. cerevisiae6525 DNA作為模板擴增3個基因的上下游6個同源臂序列：12 up，12 down，20 up，20 down，21 up，21 down，具體引物序列見表1。

以PsXR基因為例構建整合質粒的流程如圖1所示。根據(jù)引物兩端所連接的酶切位點將所有片段依次連接，形成3個基因盒。將3個基因盒分別連接在pAUR135載體骨架上，獲得表達單個基因的表達載體。

圖1 基于質粒pAUR135的目標基因染色體整合表達示意圖 (以PsXR構建為例；虛線代表同源區(qū)域，實線代表交換區(qū)域)Fig. 1 Schematic diagram of pAUR135-based combinational chromosomal integration (construction of PsXR gene was presented as an example). Dashed lines represent homologous arms and solid lines represent exchanged regions.

1.3.2 載體線性化和釀酒酵母轉化

基因盒的線性化酶切位點分別為SpeⅠ和EcoRⅠ。利用電轉方法將3個線性化的載體依次轉入釀酒酵母中，從而獲得染色體3個位點分別整合3個木糖代謝基因的染色體組合整合重組酵母菌株。

1.3.3 三個木糖基因的酶活測定

粗酶液的制備和酶活的檢測方法參考Eliasson等的文章[12]。每個酶活實驗都重復3次，以平均值作為酶活數(shù)據(jù)。

1.3.4 重組釀酒酵母乙醇發(fā)酵

重組菌株在YPD培養(yǎng)基以30 ℃、200 r/min進行限氧發(fā)酵。初始接種的OD600為2.0。發(fā)酵培養(yǎng)基為YP培養(yǎng)基 (蛋白胨2%，酵母提取物1%) 分別加入3種混合糖濃度：20 g/L木糖和40 g/L葡萄糖；25 g/L木糖和50 g/L葡萄糖；30 g/L木糖和60 g/L葡萄糖。木糖利用率計算方法為：利用率(%)=(初始木糖濃度–剩余木糖濃度)/初始木糖濃度。

2 結果與分析

2.1 基因盒各個片段的PCR擴增結果

所連接的同源臂20 up和20 down將PsXR定位為PRCdelta15位點，PsXDH定位于染色體YPRCtau3位點，ScXK基因定位于染色體YIRCdelta6位點[5]。另外PsXR和PsXDH基因分別連接PGK1啟動子，ScXK基因連接ADH1啟動子，3個基因全部使用CYC1終止子。

2.2 三個基因盒的構建及菌株穩(wěn)定性

將各個組成片段通過雙酶切連接在一起，構建完整的基因盒載體pAUR-PsXR、pAUR-PsXDH和pAUR-ScXK。然后利用內切酶進行載體的單酶切，鑒定片段大小后電轉入工業(yè)釀酒酵母中，得到的重組木糖酵母菌傳代 180次后仍保持相應性狀，所轉入的片段與傳代前片段完全吻合，測序結果也相同，說明利用該方法構建的重組菌可以在工業(yè)育種生產中保持穩(wěn)定遺傳。

2.3 重組釀酒酵母木糖代謝途徑基因的酶活水平比較

在構建的重組組合整合菌株中，XR在輔因子為NADPH時的酶活大于輔因子為NADH時的酶活。XDH的酶活水平僅為 XR酶活的 36%。XK的酶活水平最低，為XDH的77.8%。三個基因所用的啟動子強度接近，而且 3個基因都是單拷貝整合，所以表達強度的差異主要來自整合位點的不同。與對照菌株中的3個酶活力相比，染色體組合整合菌株的XR和XDH酶活明顯提高 (表2)。

表2 重組菌株的木糖代謝關鍵酶酶活比較Table 2 Comparison of enzyme activities in the recombinant strains

2.4 重組釀酒酵母混合糖發(fā)酵分析

將構建的染色體組合整合的木糖重組菌在含有葡萄糖和木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行限氧發(fā)酵。與對照重組菌株相比，染色體組合整合的重組菌株的木糖利用率提高了24.4%–35.5% (表3)。發(fā)酵結果表明，染色體組合整合表達的基因可以成功實現(xiàn)酵母菌株發(fā)酵性能的優(yōu)化 (葡萄糖數(shù)據(jù)未列出)。

表3 重組菌株的木糖利用率比較Table 3 Xylose utilization rate in the recombinant strains

3 結論與展望

利用pAUR135酵母整合表達載體，成功構建了染色體多位點組合整合的酵母菌株，所獲得的菌株可穩(wěn)定遺傳。構建基于pAUR135的整合表達載體，通過改換不同強度啟動子，增加基因拷貝數(shù)，變換染色體整合位點等手段實現(xiàn)基因表達量的組合控制，從而可實現(xiàn)多基因表達的平衡。文中提供的載體構建方式可以方便應用于工業(yè)釀酒酵母，是工業(yè)酵母菌育種的一種新方法。

[1]Zhang XR, Shen Y, Shi WL, et al. Ethanolic cofermentation with glucose and xylose by the recombinant industrial strainSaccharomyces cerevisiaeNAN-127 and the effect of furfural on xylitol production.Bioresour Technol, 2010, 101(18)： 7093–7099.

[2]Kato H, Matsuda F, Yamada R, et al. Cocktail δ-integration of xylose assimilation genes for efficient ethanol production from xylose inSaccharomyces cerevisiae. J Biosci Bioeng, 2013, 116(3)： 333–336.

[3]Kaneko S, Tanaka T, Noda H, et al. Marker-disruptive gene integration andURA3recycling for multiple gene manipulation inSaccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 83(4)： 783–789.

[4]Li Q, Zhao XQ, Chang AK, et al. Ethanol-induced yeast flocculation directed by the promoter ofTPS1encoding trehalose-6-phosphate synthase 1 for efficient ethanol production. Metab Eng, 2012, 14(1)： 1–8.

[5]Bai DM, Siewers V, Huang L, et al. Characterization of chromosomal integration sites for heterologous gene expression inSaccharomyces cerevisiae. Yeast, 2009,26(10)： 545–551.

[6]Misteli T. Beyond the sequence： cellular organization of genome function. Cell, 2007, 128(4)： 787–800.

[7]Chen M, Licon K, Otsuka R, et al. Decoupling epigenetic and genetic effects through systematic analysis of gene position. Cell Rep, 2013, 3(1)： 128–137.

[8]Gueldener U, Heinisch J, Koehler GJ, et al. A second set ofloxPmarker cassettes for Cre-mediated multiple gene knockouts in budding yeast. Nucleic Acids Res, 2002,30(6)： e23.

[9]Demeke MM, Dietz H, Li YY, et al. Development of a D-xylose fermenting and inhibitor tolerant industrialSaccharomyces cerevisiaestrain with high performance in lignocellulose hydrolysates using metabolic and evolutionary engineering. Biotechnol Biofuels, 2013, 6：89.

[10]Lu CF, Jeffries T. Shuffling of promoters for multiple genes to optimize xylose fermentation in an engineeredSaccharomycescerevisiaestrain. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(19)： 6072–6077.

[11]Zhao XQ, Jiang RJ, Bai FW. Directed evolution of

promoter and cellular transcription machinery and its application in microbial metabolic engineering- a review.Chin J Biotech, 2009, 25(9)： 1312–1315 (in Chinese).

趙心清, 姜如嬌, 白鳳武. 啟動子和細胞全局轉錄機制的定向進化在微生物代謝工程中的應用. 生物工程學報, 2009, 25(9)： 1312–1315.

[12]Eliasson A, Christensson C, Fredrik-Wahlbom C, et al.Anaerobic xylose fermentation by recombinantSaccharomyces cerevisiaecarryingXYL1,XYL2, andXKS1in mineral medium chemostat cultures. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(8)： 3381–3386.