創(chuàng)建可視化的家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)家蠶二分濃核病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1

李國輝，王鵬，李芒芒，徐五，胡朝陽，姚勤

江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) (BEVS) 是四大真核表達(dá)系統(tǒng)之一，與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，BEVS具有一些獨特的優(yōu)越性，具體表現(xiàn)在：第一，外源基因在多角體強(qiáng)啟動子的控制下，其表達(dá)產(chǎn)量較高；第二，BEVS具有能同時表達(dá)多個基因以及大片段DNA的能力；第三，表達(dá)產(chǎn)物具有正確的折疊以及翻譯后加工、修飾等特性；第四，由于桿狀病毒不感染脊椎動物，是一個相對安全的生物表達(dá)系統(tǒng)[1-4]。苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)或家蠶核型多角體病毒(BmNPV) 是BEVS中常利用的桿狀病毒表達(dá)載體，所表達(dá)出來的蛋白產(chǎn)物與其對應(yīng)的天然產(chǎn)物具有相近的生物活性、抗原性和免疫原性，是一種非常理想的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[5-6]。自1985年利用該系統(tǒng)首次成功表達(dá)人干擾素-β(IFN-β) 以來，現(xiàn)已包括白介素 1-3 (IL-1、IL-2、IL-3) 以及病毒來源的蛋白都獲得表達(dá)，并對其進(jìn)行了后續(xù)的功能研究，進(jìn)而為蛋白藥物以及高效價基因工程疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[7-10]。

BEVS在生產(chǎn)實踐中已有近30年的應(yīng)用歷程，如今，BEVS已被廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)、疫苗生產(chǎn)、生物殺蟲劑和基因治療等研究領(lǐng)域中[11-14]。利用 BEVS表達(dá)外源蛋白，需要將重組桿粒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞制備具有感染性的重組病毒粒子[15-17]，因此有效地判斷轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中是否成功地產(chǎn)生了重組病毒粒子，是后續(xù)實驗中靶蛋白獲得表達(dá)的一個重要前提。通過比較轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞形態(tài)變化，經(jīng)驗豐富的研究人員能夠判定感染性病毒粒子產(chǎn)生的情況，而初學(xué)者難免不會作出誤判，不利于重組病毒粒子的鑒定及后續(xù)研究的進(jìn)行。為此，本研究在 BEVS中引入綠色熒光基因，構(gòu)建了BmNPV來源的極早期基因ie1啟動子控制egfp基因表達(dá)盒和多角體啟動子控制外源基因雙表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)座將這兩個啟動子控制下的雙表達(dá)盒插入到家蠶穿梭載體Bm-Bacmid中，創(chuàng)建一個整合型表達(dá)egfp和靶基因的重組Bm-Bacmid，進(jìn)而利用可視化的綠色熒光信號，來快速判定重組桿粒 DNA在轉(zhuǎn)染后的家蠶BmN細(xì)胞中病毒粒子的產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞和試劑

用于質(zhì)?？寺〉拇竽c埃希菌Escherichia coliTG1及含有家蠶穿梭質(zhì)粒 Bm-Bacmid的DH10B宿主菌在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，含有pFastBacI質(zhì)粒的大腸桿菌 DH5α以及含有pFastHTB質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α保存于本實驗室。家蠶BmN細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的TC-100昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中，在27 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)的家蠶BmN細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染及病毒感染實驗。pMD18T-egfp和pMD18T-ns1載體由本實驗室保存。卡那霉素、氨卞青霉素和四環(huán)素購自Sigma公司。SnaBⅠ、BamHⅠ、KpnⅠ、EcoRⅠ、SpeⅠ、XbaⅠ、NheⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶、Taq酶和pMD18-T載體購自寶生物工程 (大連) 有限公司。IPTG 和 X-gal購自上海朝瑞生物公司。引物合成和序列測定由上海生工生物工程公司完成。

1.2 重組質(zhì)粒 pFastBacI-Pie1-egfp-sv40-Ppolh

的構(gòu)建

為擴(kuò)增桿狀病毒BmNPV基因組中的極早期基因ie1啟動子，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計兩條特異性引物ie1-F和ie1-R(表1)，通過PCR從BmNPV基因組中擴(kuò)增 560 bp長的DNA片段，對擴(kuò)增后的 DNA片段分別進(jìn)行SnaBⅠ和BamHⅠ單酶切，將酶切后的目的DNA進(jìn)行切膠純化，并將純化后的 DNA克隆到pFastHTB載體上產(chǎn)生重組質(zhì)粒 pFastHTB-Pie1；為擴(kuò)增egfp基因序列全長，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計兩條特異性引物egfp-F和egfp-R，通過PCR擴(kuò)增得到720 bp的egfp基因全長序列，對擴(kuò)增得到的目的 D N A片段進(jìn)行BamHⅠ/KpnⅠ雙酶切，對雙酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，并將回收后的產(chǎn)物與載體pFastHTBPie1進(jìn)行連接，結(jié)果產(chǎn)生重組質(zhì)粒 pFastHTBPie1-egfp。

1.3 重組質(zhì)粒 pFastBacI-Pie1-egfp-sv40-

Ppolh-ns1-sv40的構(gòu)建

1.4 重組桿粒Bm-Bacmid的構(gòu)建

1.5 重組病毒粒子的制備

將經(jīng)PCR鑒定正確的重組克隆接種在含有3 種抗生素 K+G+T+(50 μg/mL 卡那霉 素、7 μg/mL慶大霉素、10 μg/mL四環(huán)素)的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、225–320 r/min的條件下培養(yǎng)48 h后；取1.5 mL培養(yǎng)的菌液離心，對離心后的菌體抽提重組桿粒。在脂質(zhì)體 Cellfectin?Ⅱ(Cat.no.10362-100)的介導(dǎo)下，將上述抽提的重組桿粒DNA轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，通過熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行熒光觀察；為進(jìn)一步證實產(chǎn)生的重組病毒粒子是否具有感染性，收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，將其與BmN細(xì)胞孵育1 h后，棄上清，添加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，通過熒光顯微鏡對感染后的細(xì)胞在不同時間點進(jìn)行連續(xù)觀察。

1.6 Western blotting分析

對重組桿粒DNA轉(zhuǎn)染后的BmN細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微觀察，收集能觀察到綠色熒光的轉(zhuǎn)染孔中的細(xì)胞培養(yǎng)上清，將收集的轉(zhuǎn)染上清感染BmN細(xì)胞，進(jìn)而收集感染4 d后的BmN細(xì)胞，對感染后的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blotting分析，由于表達(dá)的NS1蛋白N端融合有6×His 的序列標(biāo)簽，用抗6×His Tag單克隆抗體 (Earthox)為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗小鼠IgG (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司) 為二抗，顯色底物為 BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒 (海門碧云天生物技術(shù)有限公司)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒 pFastBacI-Pie1-egfp-sv40-Ppolh的構(gòu)建策略

2.2 重組質(zhì)粒 pFastBacI-

2.3 重組桿粒 Bm-Bacmid-

2.4 重組桿粒DNA轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞后的熒光顯微觀察

通過轉(zhuǎn)座將ie1早期啟動子控制下的egfp表達(dá)盒引入到家蠶 Bm-Bacmid中，重組桿粒DNA在脂質(zhì)體Cellfectin的介導(dǎo)下進(jìn)入BmN細(xì)胞中，對轉(zhuǎn)染后的BmN細(xì)胞不同的時間點連續(xù)進(jìn)行熒光顯微觀察，鑒定重組 Bm-Bacmid在BmN細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。熒光顯微結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染24 h后，在BmN細(xì)胞中能看到零星的綠色熒光信號，隨著時間的延長，綠色熒光信號越來越多 (圖4 A)；為驗證轉(zhuǎn)染上清中是否產(chǎn)生了重組芽生型病毒粒子以及是否具有感染性，收集轉(zhuǎn)染96 h后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，將其與新培養(yǎng)的BmN細(xì)胞進(jìn)行孵育，24 h后，熒光顯微結(jié)果表明：在轉(zhuǎn)染上清孵育的BmN細(xì)胞中能觀察到綠色熒光，隨著時間的延長，熒光信號越來越多；96 h后，整個視野中都充滿了綠色熒光信號 (圖4 B)，這些結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清中已產(chǎn)生了具有感染性的重組病毒粒子；由此可見，可視化綠色熒光信號的介入有助于我們快速判定重組病毒粒子的產(chǎn)生，以及重組病毒粒子是否能夠啟動下一輪感染。

2.5 NS1蛋白的表達(dá)和鑒定

圖5 NS1蛋白的Western blotting分析Fig. 5 Western blotting analysis of target protein NS1 expressed in BmN cells. M： standard protein marker; 1：negative control; 2： sample of NS1 protein.

3 討論

桿狀病毒是一種非人源化的病毒，只特異性地感染無脊椎動物，現(xiàn)已被遺傳改造為真核表達(dá)載體，實踐證明改造后的桿狀病毒是一種非常有效的蛋白表達(dá)載體，已廣泛用于外源基因的表達(dá)并成功表達(dá)上千種功能蛋白[7,22-24]；除此之外，桿狀病毒囊膜上還可展示異源蛋白，以及通過 BEVS在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異源病毒的一些結(jié)構(gòu)蛋白，使其在胞內(nèi)組裝成病毒樣顆粒，可用來制備高效價的病毒疫苗；利用桿狀病毒在哺乳細(xì)胞內(nèi)不能增殖的特性，將其改造為基因治療載體，在靶向治療人類疾病方面擁有巨大的應(yīng)用前景[1]。

利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因，從重組病毒感染的細(xì)胞中純化表達(dá)的靶蛋白，在體外對純化后的靶蛋白進(jìn)行活性分析，這是目前對未知基因功能研究常用的一種方法。然而，桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)也有許多不足之處有待于進(jìn)一步改進(jìn)，尤為突出的是重組病毒感染細(xì)胞后會導(dǎo)致細(xì)胞裂解，顯著降低靶蛋白的表達(dá)產(chǎn)量，從而增加了外源蛋白表達(dá)所需的成本和時間[25]；另外，連續(xù)多次感染昆蟲細(xì)胞后產(chǎn)生的重組病毒容易發(fā)生目的基因丟失，致使靶蛋白表達(dá)產(chǎn)量降低甚至不表達(dá)[26]；其次，還有一些具有特殊理化性質(zhì)的蛋白，比如豬瘟病毒 ( CSFV) E2蛋白[27]，其在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)量偏低或者根本不表達(dá)，而 Western blotting往往檢測不到這一類蛋白的表達(dá)，由此讓我們對表達(dá)流程中的系列步驟產(chǎn)生質(zhì)疑，需要對實驗過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物逐一進(jìn)行驗證，尤其需要對轉(zhuǎn)染后的昆蟲細(xì)胞中是否產(chǎn)生了重組病毒粒子進(jìn)行鑒定，而反復(fù)通過RT-PCR和Western blotting來對實驗中的每個步驟進(jìn)行驗證，耗時、耗力、且浪費試劑，因此快速、有效地鑒定轉(zhuǎn)染后的昆蟲細(xì)胞中已產(chǎn)生具有感染性的重組病毒粒子，不僅與靶基因能否在BEVS中順利表達(dá)直接相關(guān)，同時也是用來判定外源基因在 BEVS中表達(dá)或不表達(dá)的一個重要參數(shù)。

本文實驗結(jié)果表明：通過構(gòu)建整合性表達(dá)egfp的重組 Bm-Bacmid，是一種可行、有效地且能夠快速判定轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中是否產(chǎn)生了感染性的重組病毒粒子，利用該整合型表達(dá)載體成功地表達(dá)了家蠶二分濃核病毒(BmBDV)非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1。NS1蛋白的快速表達(dá)，為進(jìn)一步揭示NS1蛋白的磷酸化表達(dá)模式與功能機(jī)制之間的相互關(guān)系以及為表達(dá)其他外源基因奠定了堅實的科學(xué)基礎(chǔ)；同時也極大地促進(jìn)和優(yōu)化了桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在外源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。

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