畢赤酵母表達(dá)gp96-scFv抗體及生物活性測(cè)定

桂明明，武慧英，孫璐，徐亞星，趙報(bào)，李鑫，李長(zhǎng)菲，王希東，孟頌東

1 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052 2中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 中國(guó)科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 3中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

gp96是存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分子量約為96 kDa的熱休克蛋白 (又稱GRP94)[1]。它屬于HSP90家族，是胞質(zhì)HSP90的旁系同源蛋白，約占細(xì)胞總蛋白的1%，在細(xì)胞各種代謝功能中都起著重要的作用[2]。gp96具有結(jié)合多肽的能力，因而在抗原加工、呈遞中發(fā)揮重要作用。內(nèi)源性或外源性抗原進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞中蛋白酶體降解，通過(guò)TAP分子進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，進(jìn)而與MHC (主要組織相容性復(fù)合物)Ⅰ類(lèi)或Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合，供CD8+T細(xì)胞或CD4+T細(xì)胞識(shí)別[3]。研究表明gp96能結(jié)合進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的抗原肽并將結(jié)合的抗原呈遞給 MHCⅠ類(lèi)或Ⅱ類(lèi)分子，在 T細(xì)胞識(shí)別抗原的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4-6]。gp96作為一種重要的熱休克蛋白，與多種疾病及腫瘤的發(fā)生相關(guān)[7-8]。因此，獲得特異性結(jié)合gp96的抗體檢測(cè)gp96的表達(dá)，同時(shí)作為靶向 gp96治療來(lái)抑制有關(guān)疾病和腫瘤的發(fā)生[9-11]，具有很重要的意義。

目前市場(chǎng)上已有的gp96抗體大都是兔源、鼠源的單克隆或多克隆抗體。而腹水法生產(chǎn)的單抗或多抗往往含有較多的宿主性成分，應(yīng)用于臨床特別是體內(nèi)治療時(shí)可能引起一些麻煩(例如引起患者不適)，此外腹水法自身也無(wú)法滿足工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生及科研領(lǐng)域?qū)贵w日益增長(zhǎng)的需求。由于各種原因，研究者紛紛開(kāi)展新型抗體研究來(lái)滿足對(duì)抗體的日益需求[12]。新型小分子抗體單鏈可變區(qū)片段 (scFv) 是由一彈性接頭 (Linker) 將VH和VL連接而成的兩個(gè)可變區(qū)首尾相接的單一肽鏈，通過(guò)正確折疊，兩個(gè)可變區(qū)由非共價(jià)鍵形成具有抗原結(jié)合功能的Fv段，此單一肽鏈的結(jié)構(gòu)既有利于表達(dá)和進(jìn)行基因重組操作，又增加了Fv的穩(wěn)定性[13]。scFv抗體具有抗原結(jié)合部位的最小功能結(jié)構(gòu)單位。以分子量小、體內(nèi)半衰期短、免疫原性低、易于基因工程操作等特點(diǎn)而倍受關(guān)注[14]。已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了鼠源的scFv[15]和Fab[16]小分子抗體。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，真核表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳操作方便、培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)明和適合高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)；真核表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母具有分泌表達(dá)和二硫鍵加工等翻譯后修飾的能力。因此許多在大腸桿菌中難以表達(dá)的重組蛋白在畢赤酵母中得以成功表達(dá)。另外，由于畢赤酵母遺傳性狀穩(wěn)定、生產(chǎn)成本較低、蛋白表達(dá)量高，因此其在生物制藥業(yè)中受到越來(lái)越多的關(guān)注[17-18]。文中通過(guò)構(gòu)建畢赤酵母scFv抗體pPICZα-A表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行分泌表達(dá)，獲得與 gp96特異性結(jié)合的 scFv小分子抗體，為gp96蛋白的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體菌株、細(xì)胞株

畢赤酵母菌株X33及表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-A購(gòu)自 Invitrogene公司 (美國(guó))；大腸桿菌 DH5α、293T細(xì)胞系、人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA marker為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；博萊霉素 (Zeocin)購(gòu)自 Invitrogene公司 (美國(guó))；分子量蛋白marker、PVDF膜購(gòu)自 Promega公司；小鼠抗His-Tag mAb、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗小鼠 IgG-FITC為北京中杉金橋公司產(chǎn)品；Anti-His- HRP為Santa Cruze Biotech產(chǎn)品；gp96兔多克隆抗體為Enzo產(chǎn)品；DMEM、1640細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自 Gibco公司；質(zhì)粒膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；Anti-His-tag親和層析柱(His-Trap HP)為GE公司產(chǎn)品。

1.1.3 PCR引物

根據(jù)gp96-scFv抗體片段序列設(shè)計(jì)引物：上游 引 物 (5′-CGGAATTCCAGGTGCAGCTGGT GCAG-3′)，引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物(5′-CGTCTAGATGAGTGGTGGTGGTGGTGAC C-3′)，引入XbalⅠ酶切位點(diǎn)和His標(biāo)簽。

1.2 方法

1.2.1 gp96-scFv基因的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù) gp96-scFv的基因序列 (GenBank Accession No. AJ252276.1)[19]，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成該基因。

1.2.2 pPICZα-gp96-scFv重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以合成的gp96-scFv基因序列為模板設(shè)計(jì)引物，利用TaqDNA聚合酶進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)增反應(yīng)，將擴(kuò)增產(chǎn)物和pPICZα-A質(zhì)粒分別用EcoRⅠ和XbalⅠ雙酶切，回收、連接，獲得 pPICZαgp96-scFv重組表達(dá)載體，并對(duì)其進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。

1.2.3 酵母菌轉(zhuǎn)化、篩選及鑒定

將上述重組質(zhì)粒和空載體pPICZα-A分別用SacⅠ單酶切，用Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀 (270 V，11 ms)將線性化后的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至畢赤酵母株 X33中。取轉(zhuǎn)化菌涂布于含有 100 mg/L Zeocin的YPDS平板上，于28–30 ℃溫箱中培養(yǎng)2–3 d。將抗性篩選轉(zhuǎn)化子梯度接于含 500、800、1 000 mg/ L Zeocin的YPDS固體培養(yǎng)基上，48 h左右觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)情況。挑取1 000 mg/ L Zeocin平板中單菌落接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28–30 ℃培養(yǎng)16–20 h。提取酵母菌基因組DNA，PCR鑒定目的基因是否整合成功。

1.2.4 甲醇誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

取陽(yáng)性菌液接種于100 mL BMGY培養(yǎng)液中，于28–30 ℃培養(yǎng)至OD600值為2.0–6.0時(shí)，3 000 r/min離心5 min收集菌體，用適量體積的BMMY培養(yǎng)基重懸，使OD600值為1.0左右。加入甲醇溶液誘導(dǎo)表達(dá)使其終濃度維持在0.5%–1% (每24 h補(bǔ)加1次甲醇)，培養(yǎng)4 d分別在各誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間點(diǎn) (0、12、24、36、48、72、96 h) 各取1 mL發(fā)酵液，采用斑點(diǎn)雜交法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.2.5 目的蛋白的純化和鑒定

采用Anti-His-tag親和層析柱 (His-Trap HP)對(duì)表達(dá)的scFv進(jìn)行純化，具體步驟見(jiàn)純化試劑盒說(shuō)明書(shū)。通過(guò)SDS-PAGE和Western blotting對(duì)純化目的蛋白進(jìn)行鑒定。

1.3 gp96-scFv抗體生物活性的測(cè)定

1.3.1 Western blotting方法評(píng)價(jià)gp96-scFv抗體對(duì)SK-BR-3細(xì)胞gp96蛋白的檢測(cè)活性

將培養(yǎng)的 SK-BR-3細(xì)胞去培養(yǎng)基后，PBS洗2–3遍，加入500 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解1 h，收集細(xì)胞裂解液，12 000 r/min離心30 min，取上清，與SDS電泳上樣緩沖液混勻后上樣，SDS電泳3 h。然后，通過(guò)電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將凝膠中分離的蛋白轉(zhuǎn)印 (恒壓 100 V，95 min) 到PVDF膜上。PVDF膜經(jīng)含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h后，用終濃度為1 μg/mL的gp96-scFv抗體于4 ℃孵育過(guò)夜。PVDF膜經(jīng)TBST漂洗后，置于含有 1 μg/mL的小鼠抗His-Tag抗體的TBST中，4 ℃孵育4 h。PVDF膜經(jīng)TBST再次漂洗后，用1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體于室溫孵育2 h。最后按Western blotting發(fā)光試劑盒的操作說(shuō)明，將膠片曝光顯影觀察結(jié)果。

1.3.2 Flow cytometry方法評(píng)估gp96-scFv抗體對(duì)SK-BR-3細(xì)胞膜表面gp96的檢測(cè)活性

SK-BR-3經(jīng)0.5 mmol/L EDTA消化處理后，收集 1×106個(gè)細(xì)胞，PBS 洗兩遍。用 200 μL PBS重懸細(xì)胞，加入純化后的gp96-scFv抗體使其終濃度為100 μg/mL，輕輕混勻，4 ℃孵育1 h。用PBS洗兩遍，以200 μL的PBS將細(xì)胞重懸，加入2 μL anti-His-FITC抗體，輕輕混勻，4 ℃避光孵育 30 min，再用 PBS洗兩遍，最終用400 μL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀觀察結(jié)果。

1.3.3 ELISA方法評(píng)估gp96-scFv抗體對(duì)gp96蛋白的檢測(cè)活性

用于包被的 gp96蛋白從人胎盤(pán)中純化提取[20]，用包被液 (25 mmol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6) 倍比稀釋10 μg gp96蛋白，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜，用PBST洗滌3次 (PBST： 0.05%Tween-20的PBS，pH 7.4) 后，每孔加200 μL封閉液封閉 (封閉液：5% BSA)，置于37 ℃孵育1 h，每孔加入100 μL 1 μg/mL封閉液稀釋的gp96-scFv抗體，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌3次后加入100 μL用封閉液稀釋的anti-His-HRP(1∶100) 抗體，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌4次。每孔加入100 μL TMB底物液避光反應(yīng)10 min后，每孔再加入 50 μL終止液 (2 mol/L硫酸)，5 min后讀取450 nm處的吸光值 (OD450)。

1.3.4 Immunofluorescence方法評(píng)估gp96-scFv抗體對(duì)MCF-7細(xì)胞膜表面gp96的檢測(cè)活性

將滅菌后的蓋玻片放入 6孔板，每孔加入3×105的 MCF-7細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜。吸去 6孔板中的培養(yǎng)液，用PBS洗1次。加入5% BSA的PBS封閉液 37 ℃封閉 15 min。加入純化后的gp96-scFv抗體使其終濃度為100 μg/mL，孵育1 h，PBS洗 3次。加入用封閉液稀釋后的anti-His-FITC (1∶100) 抗體避光孵育1 h。PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，吸去多聚甲醛固定液，PBS洗 3次。在載玻片上滴一滴封片劑，用鑷子輕輕夾出蓋玻片，用吸水紙將殘留的液體吸干。最后用中性樹(shù)膠封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 pPICZα-gp96-scFv重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

以合成gp96-scFv抗體序列為模板，PCR擴(kuò)增該基因片段，結(jié)果在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)1條約 300 bp的 DNA條帶，同預(yù)期結(jié)果相符(圖 1A)。以EcoRⅠ和XbalⅠ雙酶切的 PCR產(chǎn)物和pPICZα-A空載質(zhì)粒連接后，再用雙酶切鑒定，在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)2條分別約300 bp和 3.6 kb的 DNA條帶 (圖 1B)，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母菌Mut的鑒定

在含 500、800、1 000 mg/L不同梯度的Zeocin的YPDS固體培養(yǎng)基上抗性篩選畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，最后提取1 000 mg/L Zeocin畢赤酵母菌的基因組，PCR鑒定為陽(yáng)性重組的畢赤酵母菌，PCR產(chǎn)物包含 pPICZα-A載體和 gp96-scFv基因片段，通過(guò)EcoRⅠ和XbalⅠ雙酶切后在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)2條大小約是300 bp和3.6 kb的DNA條帶，分別為pPICZα-A載體和 gp96-scFv基因片段，同預(yù)期分子量相符合(圖 1C)。

圖1 pPICZα-gp96-scFv重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定Fig. 1 Construction and identification of pPICZα-gp96-scFv fragment recombinant plasmid. (A) The gp96-scFv fragment gene was produced by PCR from the pUC57 templates. M： DNA marker; 1–2： PCR products of gp96-scFv gene. (B) Identification of the recombinant vectors by enzyme digestion. M： DNA marker; 1： EcoR and ⅠXbalⅠdigested plasmid. (C) Identification of the Pichia pastoris colonies by PCR and enzyme digestion. M： DNA marker; 1–5： EcoRand ⅠXbalⅠdigested PCR products from positive Pichia pastoris colonies.

2.3 目的基因在畢赤酵母菌中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的畢赤酵母菌加入甲醇誘導(dǎo)不同時(shí)間后的培養(yǎng)上清進(jìn)行斑點(diǎn)雜交檢測(cè)，結(jié)果顯示以pPICZα-gp96-scFv重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，各時(shí)間點(diǎn)畢赤酵母菌的培養(yǎng)上清在硝酸纖維素膜上均出現(xiàn)斑點(diǎn)，其中第72 h出現(xiàn)的斑點(diǎn)亮度最高；而空載體轉(zhuǎn)化的畢赤酵母菌各時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)上清在硝酸纖維素膜上均未出現(xiàn)斑點(diǎn)(圖2A)。

2.4 目的蛋白的純化和鑒定

采用Anti-His-tag親和層析柱(His-Trap HP)對(duì)表達(dá)的gp96-scFv進(jìn)行純化，純化的目的產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE檢測(cè)表明，考馬斯亮藍(lán)染色的丙烯酰胺凝膠出現(xiàn)2條分子量約為15 kDa的條帶(圖2B)。Western blotting鑒定的結(jié)果顯示，純化的目的蛋白在膠片上出現(xiàn)1條分子量為15 kDa的蛋白條帶；而空載體轉(zhuǎn)化的畢赤酵母菌發(fā)酵液作為陰性對(duì)照則沒(méi)有相應(yīng)的條帶 (圖2C)，并且條帶位置同預(yù)期分子量大小基本相同。同時(shí)，將人胎盤(pán)中純化的gp96蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)染色的丙烯酰胺凝膠出現(xiàn)1條分子量約為96 kDa的明顯條帶，再使用商業(yè)化的gp96兔多克隆抗體或gp96-scFv抗體對(duì)人胎盤(pán)gp96蛋白和牛血清白蛋白 (BSA) 作為陰性對(duì)照進(jìn)行Western blotting雜交，Western blotting結(jié)果顯示均能出現(xiàn)明顯雜交條帶 (圖2D)，結(jié)果表明純化的蛋白是96-scFv抗體，且能夠結(jié)合 gp96蛋白。

2.5 gp96-scFv抗體生物活性檢測(cè)

2.5.1 gp96-scFv抗體的Western blotting檢測(cè)

SK-BR-3細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞裂解液處理后，分別取0、20、30 μg細(xì)胞裂解液上清進(jìn)行SDS-PAGE。轉(zhuǎn)膜以后將 PVDF膜與 1 μg/mL純化后的gp96-scFv抗體4 ℃孵育過(guò)夜。最后按Western blotting發(fā)光試劑盒的操作說(shuō)明，將膠片爆光顯影觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，在膠片上出現(xiàn) 1條分子量約為96 kDa的蛋白條帶；而陰性對(duì)照則無(wú)此條帶 (圖3A)。同時(shí)，將野生型HepG2細(xì)胞和siRNA穩(wěn)定敲低gp96的HepG2細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞裂解液處理后，分別取 30 μg上清蛋白進(jìn)行 Western blotting，結(jié)果顯示 siRNA穩(wěn)定敲低 gp96細(xì)胞相對(duì)于野生型細(xì)胞條帶明顯變?nèi)?(圖3A下)，這些結(jié)果均表明96-scFv抗體能夠特異結(jié)合gp96蛋白。

圖3 gp96-scFv抗體生物活性檢測(cè)Fig. 3 Detection of the biological activities of gp96-scFv antibody. (A) Western blotting detection of endogenous gp96 in SK-BR-3 cells (up), and HepG2 cells or HepG2 cells stably transfected with gp96 RNAi (down) using gp96-scFv antibody. (up) lane 1： PBS as a negative control; 2–3： different amounts of SK-BR-3 cells lysates. (down)1： HepG2 cells lysates; 2： cell lysates of HepG2 cells stably transfected with gp96 siRNA. (B) FACS analysis of cell surface gp96 in SK-BR-3 cells using gp96-scFv antibody. Mouse control IgG serves as a negative control. gp96 Rabbit polyclonal antibody serves as a positive control. (C) ELISA analysis of gp96-scFv antibody. gp96 Rabbit polyclonal antibody serves as a positive control. (D) Immunofluorescence staining of unpermeabilized MCF-7 cells and 293T cells (as a negative control) using gp96-scFv antibody. Bar=30 μm.

2.5.2 gp96-scFv抗體的Flow cytometry檢測(cè)

用EDTA處理SK-BR-3細(xì)胞后，分別向細(xì)胞中加入1∶100 gp96 兔多克隆抗體和100 μg/mL表達(dá)純化的96-scFv抗體，其中g(shù)p96 兔多克隆抗體處理組為陽(yáng)性對(duì)照組，不加96抗體為陰性對(duì)照組。孵育后分別加入FITC標(biāo)記的熒光二抗，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照和純化96-scFv抗體處理的都出現(xiàn)峰明顯的偏移 (圖3B)。Flow cytometry結(jié)果表明gp96-scFv抗體能夠結(jié)合細(xì)胞膜表面gp96。

2.5.3 gp96-scFv抗體的ELISA檢測(cè)

將純化的gp96蛋白10 μg依次梯減倍比稀釋包被，用1 μg/mL純化后的gp96-scFv抗體，同時(shí)加入1∶1 000 gp96兔多克隆抗體處理組為陽(yáng)性對(duì)照組，經(jīng)Anti-His-HRP二抗孵育顯色后在 450 nm 讀取的吸光值 (OD450) (圖 3C)gp96-scFv抗體檢測(cè)的 gp96蛋白最低濃度為50 pg/μL。ELISA結(jié)果表明重組表達(dá)gp96-scFv抗體具有比商業(yè)化gp96兔多克隆抗體 (Enzo產(chǎn)品) 有更強(qiáng)的靈敏度和親和力。

2.5.4 gp96-scFv抗體的 Immunofluorescence檢測(cè)

3 討論

本研究構(gòu)建了重組載體pPICZα-gp96-scFv，使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白gp96-scFv抗體片段，且獲得具有較高親和力和特異性的抗 gp96蛋白的分泌型 scFv小分子抗體[21-22]。在畢赤酵母表達(dá)的目的蛋白 gp96-scFv抗體篩選體系中不僅限于傳統(tǒng)的PCR、RT-PCR及分子雜交等方法篩選，而且利用畢赤酵母其強(qiáng)大的分泌功能對(duì)蛋白直接篩選鑒定，本研究篩選多拷貝整合轉(zhuǎn)化子是參照了Schagger等[23]的斑點(diǎn)雜交方法，由于本研究中工程菌gp96-scFv基因的密碼子是畢赤酵母利用頻率最高的密碼子，同時(shí)工程菌是通過(guò)斑點(diǎn)雜交篩選的拷貝數(shù)較高的轉(zhuǎn)化子，因此該畢赤酵母菌具有能高效分泌表達(dá)的能力。

畢赤酵母表達(dá)目的蛋白 gp96-scFv抗體片段通過(guò)在C端連接His標(biāo)簽是為了方便純化和鑒定，采用Anti-His-tag親和層析柱 (His-Trap HP) 對(duì)表達(dá)的 gp96-scFv進(jìn)行純化的方法，能保持蛋白的生物活性，操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，而且可重復(fù)使用[24]。通過(guò) Anti-His-tag親和層析柱純化目的蛋白的純度能達(dá)到 95%，在經(jīng)過(guò)截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 kDa膜進(jìn)行超濾濃縮，濃縮后的目的蛋白純度效果更好。本研究中的目的蛋白在電泳SDS-PAGE圖中的條帶大小位置與預(yù)期蛋白的分子量大小接近，并通過(guò) Western blotting鑒定了目的蛋白。并對(duì)純化的目的蛋白通過(guò) Western blotting、Flow cytometry、Immunofluorescence等分析方法鑒定其生物活性，結(jié)果表明gp96-scFv抗體是具有較高親和力和特異性抗 gp96蛋白的 scFv小分子抗體，ELISA試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)的 gp96-scFv抗體對(duì)gp96蛋白檢測(cè)的靈敏度和親和力高于市售的商業(yè)化抗體。

利用畢赤酵母可大量和相對(duì)廉價(jià)地表達(dá)scFv抗體片段，用于 Western blotting、Immunofluorescence、ELISA和Flow cytometry檢測(cè)gp96蛋白。scFv抗體片段的最大優(yōu)點(diǎn)是能增強(qiáng)熒光激活細(xì)胞分類(lèi)篩選(Fluorescenceactivated cell sorting, FACS) 和ELISA檢測(cè)等許多免疫化學(xué)應(yīng)用中的靈敏性和效率[25]；其次，scFv片段一般設(shè)計(jì)某種形式的“標(biāo)簽”(如組氨酸或 E-tag標(biāo)簽) 可用于快速檢測(cè)和純化 gp96蛋白分子；此外，相對(duì)于傳統(tǒng)抗體，由于 scFv抗體分子小，有較強(qiáng)穿透能力，適合于腫瘤的檢測(cè)和靶向治療[26-27]。因此scFv片段抗體能夠廣泛地應(yīng)用于臨床檢測(cè)、治療和免疫化學(xué)等

領(lǐng)域[28-30]。

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