煙草毛狀根多倍體誘導(dǎo)及其植株再生

侯麗麗，施和平，余武，曾寶強(qiáng)，周卓輝

1 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510631 2 香港教育學(xué)院科學(xué)與環(huán)境學(xué)系，香港 新界

多倍體 (Polyploids) 在植物中廣泛存在，是植物進(jìn)化的途徑之一[1]。但由于自然界產(chǎn)生多倍體的過(guò)程相當(dāng)漫長(zhǎng)，一直以來(lái)國(guó)內(nèi)外育種學(xué)家都采用秋水仙素人工誘導(dǎo)染色體加倍的方法來(lái)獲得植物多倍體[2]。已有的研究表明，由于染色體加倍，多倍體植株不僅在根、莖、葉和花等器官上具有“巨型性”，而產(chǎn)生出較大的營(yíng)養(yǎng)器官和繁殖器官[2-3]；而且大都能顯著增強(qiáng)藥用植物的次生代謝，并能通過(guò)篩選獲得次生物質(zhì)含量及產(chǎn)量更高的優(yōu)良植物品系[4-5]。因而秋水仙素誘導(dǎo)染色體加倍的技術(shù)一直以來(lái)都被用作植物種質(zhì)創(chuàng)新的重要手段之一。然而，在利用秋水仙素人工誘導(dǎo)染色體加倍來(lái)培育多倍體植物時(shí)，大都是采用秋水仙素處理植物的葉片[6]、愈傷組織[7]、根段[8]、種子或幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)[9]等來(lái)進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)。極少見(jiàn)利用單細(xì)胞起源、可自主生長(zhǎng)的毛狀根 (Hairy roots) 用作多倍體誘變育種起始材料的研究報(bào)道。

發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞產(chǎn)生的毛狀根不僅能在無(wú)外源激素的培養(yǎng)基上快速自主生長(zhǎng)，而且具有次生代謝產(chǎn)率量高且穩(wěn)定及易通過(guò)組織培養(yǎng)途徑獲得其再生植株等優(yōu)勢(shì)[10-11]，因而應(yīng)該非常適合用作秋水仙素誘導(dǎo)多倍體的實(shí)驗(yàn)體系。如利用秋水仙素誘導(dǎo)可獲得青蒿素含量比原二倍體毛狀根高 6倍的同源四倍體青蒿毛狀根系[12]。但未見(jiàn)有關(guān)利用人工誘導(dǎo)產(chǎn)生的多倍體毛狀根及其再生植株來(lái)生產(chǎn)植物次生物質(zhì)及進(jìn)行植物種質(zhì)創(chuàng)新的更多研究報(bào)道。

為此，本文以煙草Nicotiana tabacumK326為材料，通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化獲得可自主生長(zhǎng)的煙草毛狀根后，用化學(xué)誘變劑秋水仙素對(duì)煙草毛狀根進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)及其植株再生以及其次生物質(zhì)煙堿含量的分析，旨在利用毛狀根多倍體化來(lái)進(jìn)行煙草種質(zhì)創(chuàng)新和提高其次生物質(zhì)煙堿含量，并為今后開(kāi)展利用毛狀根多態(tài)性來(lái)進(jìn)行植物多倍體育種奠定實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌菌株及培養(yǎng)

野生農(nóng)桿堿型發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacterium rhizogenesATCC15834由德國(guó) Martin-Lüther Universitaet Halle/Wittenberg的Peter Lindemann博士提供。農(nóng)桿菌在YEB固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)和保存。挑取該農(nóng)桿菌單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基中28 ℃振蕩 (160 r/min) 培養(yǎng)30 h供感染用。

1.2 煙草無(wú)菌苗的獲得及其外植體制備

按施和平等[13]的方法獲得煙草Nicotiana tabacum烤煙品種K326的無(wú)菌苗。取無(wú)菌苗的幼嫩葉片切成1–1.5 cm2左右的外植體，置于無(wú)外源激素的MS培養(yǎng)基[14]上預(yù)培養(yǎng)24 h后，用于轉(zhuǎn)化。

1.3 煙草毛狀根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

將上述預(yù)培養(yǎng)24 h的煙草葉片外植體浸入用 MS培養(yǎng)基稀釋 2倍的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834菌懸液中20 min，取出、吸干多余菌液并放回原培養(yǎng)基上共培養(yǎng) 2 d后，轉(zhuǎn)入MS+500 mg/L頭胞噻肟鈉(Cefotaxime)的無(wú)外源激素的MS培養(yǎng)基上，在25 ℃每天14 h散射光下誘導(dǎo)毛狀根。切取從葉片外植體切口中脈處產(chǎn)生的毛狀根置于含500 mg/L頭胞噻肟鈉的無(wú)外源激素的 MS培養(yǎng)基上除菌培養(yǎng)，約 5–6次繼代培養(yǎng)后，所獲得的無(wú)菌毛狀根系供進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化鑒定、植株再生以及毛狀根多倍體誘導(dǎo)用。

1.4 毛狀根的遺傳轉(zhuǎn)化鑒定

采用Ri質(zhì)粒TL-DNA (T-DNA左臂) 的rol基因的PCR擴(kuò)增和TR-DNA (T-DNA右臂) 的冠癭堿合成酶基因的表達(dá)產(chǎn)物冠癭堿的紙電泳檢測(cè)來(lái)對(duì)煙草毛狀根進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化鑒定。

1.4.1 毛狀根rol基因的PCR擴(kuò)增

取適量無(wú)菌的毛狀根，按Edward等[15]的方法提取其基因組DNA，純化后用作PCR擴(kuò)增的模板。以煙草非轉(zhuǎn)化植株根的基因組DNA作對(duì)照。根據(jù)Furner等[16]發(fā)表的序列，分別設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增rolB和rolC的PCR引物，其序列如表 1所示，均由上海生工生物工程有限公司合成。在 0.2 mL的硅化離心管中加入模板 DNA 50 ng，TaqDNA聚合酶2個(gè)單位，PCR反應(yīng)總體積為50 μL。rolB、rolC基因PCR擴(kuò)增參數(shù)如下：94 ℃ 5 min ；94 ℃變性1 min，53.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸反應(yīng) 1 min，37個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和EtBr替代染料Goldview染色進(jìn)行分析。

1.4.2 冠癭堿的檢測(cè)

毛狀根冠癭堿的檢測(cè)參照 Ellis等[17]的方法。取除菌后自主生長(zhǎng)的毛狀根系 200 mg, 加0.1 mol/L HCl 200 μL, 用玻璃棒搗成勻漿,4 000×g 離心15 min，上清液用毛細(xì)管點(diǎn)樣于3 mm 厚的Watman濾紙上, 置于高壓電泳槽中電泳。電泳條件： 40 V/cm, 1.5 h。濾紙取出風(fēng)干后置于0.2%硝酸銀丙酮溶液中30 s, 風(fēng)干后轉(zhuǎn)移到1% NaOH甲醇溶液中2 min, 最后用3%Na2S2O3溶液固定。

表1 PCR擴(kuò)增所用的引物及其序列Table 1 Primer sequences used for the PCR amplification

1.5 煙草毛狀根的植株再生

將上述遺傳轉(zhuǎn)化鑒定呈陽(yáng)性的毛狀根，切成2–3 cm的根段，分別接入添加1.0、2.0、3.0 mg/L 6-BA和0、0.1、0.2、0.3 mg/L NAA組合的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行植株再生。所有MS培養(yǎng)基均添加3%的蔗糖 (W/V)，1%的瓊脂，pH 6.0。

1.6 煙草毛狀根多倍體誘導(dǎo)及其植株再生

采用秋水仙素根尖浸泡法來(lái)進(jìn)行煙草毛狀根多倍體誘導(dǎo)。選取經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化鑒定呈陽(yáng)性、且在 MS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛、長(zhǎng)勢(shì)粗壯的毛狀根，切取其2–3 cm長(zhǎng)的根尖段，分別置于盛有含0、0.05%、0.1%和0.2% (W/V) 秋水仙素的 MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)(200 r/min)，并分別在處理12、24、36和48 h后挑選根尖明顯膨大的根尖段，用 MS液體培養(yǎng)基洗去根尖表面殘留的秋水仙素溶液和用無(wú)菌吸水紙吸干后，切取其根尖膨大部分接入添加 1.0、2.0、3.0 mg/L 6-BA 和 0、0.1、0.2、0.3 mg/L NAA組合的MS培養(yǎng)基中，進(jìn)行毛狀根多倍體的愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生。待毛狀根多倍體愈傷組織再生產(chǎn)生的叢生芽長(zhǎng)至2–3 cm高時(shí)，切取叢生芽并置于無(wú)外源激素的 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗及生根誘導(dǎo)，獲得再生植株。

1.7 毛狀根多倍體再生植株的倍性鑒定

1.7.1 根尖染色體壓片法

基本按Martinez-Gomez等[18]的方法進(jìn)行根尖細(xì)胞染色體數(shù)目觀(guān)察。取待鑒定的毛狀根多倍體再生植株根尖段放入0.1%秋水仙素溶液中預(yù)處理2 h，用蒸餾水沖洗3次，放入卡諾氏固定液中固定20 h，1 mol/L鹽酸60 ℃軟化處理8 min，蒸餾水沖洗并浸泡20 min，改良石碳酸品紅染液染色15 min后，進(jìn)行壓片和鏡檢；并按以下公式計(jì)算多倍體誘導(dǎo)率：多倍體誘導(dǎo)率=多倍體植株數(shù)/再生植株總數(shù)。

1.7.2 毛狀根多倍體再生植株保衛(wèi)細(xì)胞的觀(guān)察

按陳佰鴻等[19]的透明膠帶撕取法進(jìn)行。分別取同期培養(yǎng)的秋水仙素處理獲得的毛狀根多倍體再生植株、對(duì)照毛狀根再生植株 (二倍體)和二倍體野生型植株的成熟葉片，用剪刀剪取葉脈一側(cè)的葉片，把下表皮部分放入透明膠帶上，用大拇指用力下壓，使下表皮粘于透明膠帶上之后，用小鑷子輕輕刮去上層的葉肉組織，薄薄的下表皮則平整地粘于透明膠帶上。用剪刀將下表皮剪成 0.5 cm2左右的小塊，用 1%I-KI溶液染色1 min后，制成臨時(shí)裝片，并在顯微鏡 (40×物鏡) 下統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中保衛(wèi)細(xì)胞的個(gè)數(shù)后，再在100×油鏡下測(cè)量統(tǒng)計(jì)每個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞的大小及每個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的數(shù)目。每棵植株統(tǒng)計(jì)兩片葉片及隨機(jī)測(cè)量統(tǒng)計(jì) 10個(gè)視野，100×油鏡下統(tǒng)計(jì)10個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞的大小以及每個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的數(shù)目。

1.8 毛狀根多倍體再生植株次生物質(zhì)煙堿含量的測(cè)定

取非轉(zhuǎn)化 (野生型) 植株、毛狀根再生植株(二倍體) 及毛狀根多倍體再生植株的葉片，經(jīng)60 ℃烘干、粉碎、研磨、過(guò)100目篩后，精確稱(chēng)取其干燥粉末1.5 g，加入NaOH 0.3 g，甲醇30 mL浸泡1 h，超聲波破碎20 min及濾紙過(guò)濾后，濾液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行GC-MS測(cè)定。

煙堿含量的 GC-MS測(cè)定基本參照肖遂等的方法[20]。其測(cè)定條件為：電離方式為電子轟擊(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，連接管溫度280 ℃，溶劑延遲3 min，采用全掃描方式(Scan)；升溫程序：初溫90 ℃，以15 /min℃升至140 ℃，保持20 min，再以15 /min℃升至260 ℃，保持 5 min。GC條件：DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度 250 ℃；氫火焰離子檢測(cè)器溫度 280 ℃。載氣為 He，流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。以煙堿標(biāo)準(zhǔn)品 (Sigma)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，y= 1 388.29x– 7 351 260.48，r2=0.999 6；并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品的煙堿含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草毛狀根誘導(dǎo)與離體培養(yǎng)

未感染的煙草葉片外植體在無(wú)外源激素的MS+500 mg/L頭胞噻肟鈉的固體培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)25 d后均不生根, 僅可見(jiàn)大部分的葉片外植體變黃或變褐；或從少部分葉片外植體的形態(tài)學(xué)下端切口中脈處產(chǎn)生少量淺黃色致密的愈傷組織。經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834侵染處理共培養(yǎng)2 d后，煙草葉片外植體邊緣略增厚、翹起，并向上卷曲；5 d后從葉片外植體葉脈切口處開(kāi)始產(chǎn)生白色根原基，并逐漸發(fā)育成白色毛狀根。15 d后統(tǒng)計(jì)，葉片外植體的生根率為100%；平均每個(gè)葉片外植體產(chǎn)生3–5條毛狀根 (圖1A)。

感染20 d后，將3–5 cm長(zhǎng)的毛狀根切下并分別接種至MS+500 mg/L頭胞噻肟鈉中進(jìn)行單根除菌培養(yǎng)。經(jīng) 4–5次單根除菌培養(yǎng)后，將除菌徹底的毛狀根分別接入 MS固體及液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)毛狀根能在無(wú)外源激素的MS固體和液體培養(yǎng)基中自主生長(zhǎng)，其中固體培養(yǎng)的煙草毛狀根缺乏向地性、貼壁生長(zhǎng)、側(cè)根多而纖細(xì)；而液體培養(yǎng)的毛狀根生長(zhǎng)速度較固體培養(yǎng)更快，且主根和側(cè)根更粗壯 (圖1B和C)。所獲得的可自主快速生長(zhǎng)的毛狀根置于無(wú)外源激素的 MS培養(yǎng)基中繼代保存，供進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化鑒定和秋水仙素人工多倍體誘導(dǎo)所使用。

2.2 煙草毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化鑒定

rolB和rolC是發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒TL-DNA上的兩個(gè)生根基因。以rolB和rolC的引物分別從煙草毛狀根、非轉(zhuǎn)化根基因組DNA及發(fā)根農(nóng)桿菌單菌落擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可見(jiàn)，利用rolB和rolC的PCR 引物能從煙草毛狀根的總DNA 及發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834 單菌落克隆中分別擴(kuò)增到期望的540 bp 和770 bp左右的特異性DNA 片段，而從煙草非轉(zhuǎn)化根的總 DNA 中擴(kuò)增不到任何片段 (圖 2)。而圖 3為煙草毛狀根冠癭堿的紙電泳檢測(cè)結(jié)果。從圖3可見(jiàn), 上述經(jīng)rol基因PCR擴(kuò)增呈陽(yáng)性的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834菌株誘導(dǎo)煙草葉片外植體產(chǎn)生的毛狀根能合成甘露堿和農(nóng)桿堿，而對(duì)照根沒(méi)有檢測(cè)到農(nóng)桿堿和甘露堿。這表明發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的含rol基因的TL-T-DNA (T-DNA左臂)以及含編碼冠癭堿合成酶基因的 TR-DNA(T-DNA右臂)均已在煙草毛狀根基因組中整合和表達(dá)。

圖1 煙草毛狀根誘導(dǎo)、培養(yǎng)及其多倍體誘導(dǎo)和植株再生Fig. 1 Induction and in vitro culture of hairy roots and its polyploidy induction and plant regenerations of Nicotiana tabacum. (A) Hairy roots formation from leaf explants 15 days after infection. (B) Solid culture of hairy roots for 10 days. (C) Liquid culture of hairy roots for 10 days. (D) The swollen root tips after colchicine treatment. (E) Callus induction from hairy root after cultured for 10 days. (F) Adventitious shoot formation from callus after cultured for 30 days. (G) The chromosomes in root tip cell of control plants. (H) The chromosomes in root tip cells of diploid hairy root-derived plants. (I) The chromosomes in root tip cells of polyploid regeneration plant 1. (J) The chromosomes in root tip cells of polyploid regeneration plant 2. (K;N) The guard cells of control plants. (L;O) The guard cells of diploid hairy roots-regenerated plants. (M;P) The guard cells of polyploid-hairy roots regenerated plants. (Q) Control plants. (R) Diploid hairy roots-regenerated plant. (S) Polyploid hairy roots-regenerated plants. (T)Untransformed plants after pot-grown for 30 days. (U) Hairy root-regenerated plants after pot-grown for 30 days. (V)Polyploid hairy root-regenerated plants after pot-grown for 30 days. (W) Untransformed plants after pot-grown for 60 days. (X) Hairy root-regenerated plants after pot-grown for 60 days. (Y) Polyploid hairy root-regenerated plants after pot-grown for 60 days.

圖2 煙草毛狀根rol B和rol C基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析Fig. 2 Gel electrophoresis analysis of PCR fragments of rolB and rolC genes amplified from the genome DNA tobacco hairy roots. 1： 2 kb DNA marker; 2–6：fragments with rolB primers; 7–11： fragments with rolC primers; 2, 10： fragments amplified from the strains of A. rhizozgenes ATCC15834; 3, 8： fragments amplified from untransformed roots; 4–6, 9–11：fragments amplified from hairy roots.

圖3 煙草毛狀根冠癭堿的紙電泳檢測(cè)Fig. 3 Detection of opines in tobacco hairy roots by paper electrophoresis. 1, 2： hairy roots extract; 3, 4：normal root extract; 5： standard opines. A： agropine; M：mannopine; N.S： neutral sugars.

2.3 煙草毛狀根多倍體的誘導(dǎo)及其植株再生

將上述遺傳轉(zhuǎn)化鑒定呈陽(yáng)性且生長(zhǎng)迅速的毛狀根根尖段置于不同濃度秋水仙素的 MS培養(yǎng)基中處理12 h后發(fā)現(xiàn)，無(wú)論秋水仙素濃度高低，煙草毛狀根根尖均開(kāi)始膨大(圖 1D)，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，根尖也越來(lái)越膨大。而未經(jīng)秋水仙素處理的毛狀根根尖段 (對(duì)照) 則隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其根尖逐漸伸長(zhǎng)，但始終無(wú)膨大現(xiàn)象出現(xiàn)。

將毛狀根根尖的膨大部分切下并接入添加1.0、2.0、3.0 mg/L 6-BA和0.1、0.2、0.3 mg/L NAA組合的MS培養(yǎng)基及不含任何激素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，在不含任何激素的 MS固體培養(yǎng)基中毛狀根逐漸伸長(zhǎng)，并陸續(xù)產(chǎn)出側(cè)根，但始終無(wú)愈傷組織形成。培養(yǎng)30 d后從起始根段處直接再生出幼芽，40 d后幼芽可長(zhǎng)成4–5 cm高的小植株；但再生頻率低，約1–2株/瓶。與之相比，當(dāng)秋水仙素處理膨大的毛狀根根尖段在含不同濃度6-BA和NAA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，根尖開(kāi)始變得膨大而疏松，逐漸形成淺黃色顆粒狀的疏松愈傷組織；20 d后，淺黃色的愈傷組織逐漸變綠并開(kāi)始形成少量的綠色芽點(diǎn)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，淺黃色愈傷組織塊的體積變得越來(lái)越大，并產(chǎn)生出更多的綠色芽點(diǎn) (圖1E和F)。然而，在毛狀根多倍體植株再生過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)膨大的毛狀根根尖段在僅含6-BA的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，隨著6-BA濃度的增高，其愈傷組織出現(xiàn)時(shí)間越來(lái)越早，但所產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)地較致密，且其隨后分化所形成的綠色芽點(diǎn)也較少；而在6-BA和NAA組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，不僅膨大的毛狀根根尖段產(chǎn)生的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)較好，顏色多呈淺綠色，而且其愈傷組織分化出的綠色芽點(diǎn)也較多。其中，最適合加倍后膨大的毛狀根根段愈傷組織誘導(dǎo)及其植株再生的培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L，在該培養(yǎng)基中不僅誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織體積最大，顏色更綠，而且再分化產(chǎn)生的不定芽數(shù)量也最多，長(zhǎng)勢(shì)也最好，其不定芽分化頻率達(dá)25–30。將產(chǎn)生的綠色叢生不定芽切下、并置于無(wú)外源激素的 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生根誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d后，從其基部產(chǎn)生出較多白色的根，發(fā)育成完整植株。

2.4 毛狀根多倍體再生植株的倍性鑒定

圖1的G、H、I和J為煙草毛狀根再生植株及其毛狀根多倍體再生植株的根尖染色體倍性鑒定的結(jié)果。 從圖1G-J可見(jiàn)，對(duì)照 (煙草二倍體野生型植株) 與二倍體毛狀根再生植株根尖細(xì)胞的染色體數(shù)均為2n=48；而毛狀根多倍體再生植株根尖細(xì)胞的染色體條數(shù)明顯增多，其染色體數(shù)為4n=96，表明所獲得的煙草毛狀根多倍體再生植株為同源四倍體。

表2和圖1K、L、M、N、O和P為對(duì)照植株、二倍體毛狀根再生植株與毛狀根多倍體再生植株葉片的保衛(wèi)細(xì)胞大小形態(tài)、密度及其葉綠體數(shù)目的觀(guān)察統(tǒng)計(jì)結(jié)果。由表 2可以看出，未加倍 (二倍體) 毛狀根再生植株葉片保衛(wèi)細(xì)胞的大小及其葉綠體數(shù)目與對(duì)照相比無(wú)顯著差別，但其保衛(wèi)細(xì)胞密度較大，且葉片顏色更深；而毛狀根多倍體再生植株葉片的保衛(wèi)細(xì)胞大小則明顯比二倍體大，其長(zhǎng)度分別約為對(duì)照和二倍體毛狀根再生植株保衛(wèi)細(xì)胞的1.64倍和1.71倍，而其寬度則分別約為1.33倍和1.36倍；同時(shí)，其保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)目分別約為對(duì)照和二倍體毛狀根再生植株的2.02倍和1.86倍；但其葉片保衛(wèi)細(xì)胞的密度則較對(duì)照有所降低。這可能是由于與其體積變大，導(dǎo)致在相對(duì)的單位面積上保衛(wèi)細(xì)胞密度變小有關(guān)。

2.5 毛狀根多倍體植株的形態(tài)特征及其煙堿含量分析

表 3為煙草毛狀根多倍體誘導(dǎo)率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。從表 3可見(jiàn)，煙草毛狀根多倍體誘導(dǎo)的最適條件是0.1%的秋水仙素處理36 h，其毛狀根多倍體誘導(dǎo)率約為 64.71%。而從圖 1的 Q、R和 S可見(jiàn)，煙草毛狀根多倍體再生植株不僅具有明顯的毛狀根再生植株表型，即葉片略皺縮、節(jié)間縮短、根系發(fā)達(dá)；而且與 (二倍體) 毛狀根再生植株相比，毛狀根多倍體再生植株的葉色更深綠，葉肉更肥厚，莖桿更粗壯，呈現(xiàn)出常見(jiàn)多倍體的形態(tài)特征。圖1的T、U、V、W、X和Y為煙草多倍體毛狀根再生植株及二倍體毛狀根再生植株和非轉(zhuǎn)化野生煙草植株室外栽培30 d和60 d的生長(zhǎng)形態(tài)。從圖1 可見(jiàn)，與對(duì)照植株相比，二倍體毛狀根再生植株的葉片長(zhǎng)度比對(duì)照短，而葉片寬度也較對(duì)照略變窄；但葉片形態(tài)仍正常，植株頂端優(yōu)勢(shì)減弱，每個(gè)莖節(jié)葉腋處的側(cè)芽均發(fā)育成側(cè)枝 (圖1T和U)；而與對(duì)照相比，同源四倍體的葉片更寬而厚，但葉片表面呈現(xiàn)部分皺縮 (圖1V)；此外，對(duì)照煙草植株盆栽60 d后頂芽已明顯分化出花芽 (圖1W)，而與對(duì)照相比，無(wú)論是二倍體的毛狀根再生煙草植株還是毛狀根多倍體再生植株的開(kāi)花期明顯延遲，盆栽60 d時(shí)，其植株仍處于旺盛的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期 (圖1X和Y)；直至盆栽約81 d后才逐漸產(chǎn)生花芽，而且，所產(chǎn)生的花芽開(kāi)花后，能形成其種子可正常萌發(fā)的煙草果實(shí)。

2.6 毛狀根多倍體再生植株煙堿含量的測(cè)定

表4為盆栽60 d的煙草毛狀根多倍體再生植株及其二倍體毛狀根再生植株葉片的次生物質(zhì)煙堿含量的GC-MS測(cè)定結(jié)果。從表4可見(jiàn)，與對(duì)照 (二倍體野生型植株) 相比，經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌 ATCC15834誘導(dǎo)產(chǎn)生的煙草毛狀根再生植株以及其毛狀根多倍體再生植株不僅能合成煙堿，而且其煙堿含量均比對(duì)照高；其中以毛狀根多倍體再生植株的煙堿含量最高，達(dá)到432.52 mg/g (干重)，且分別約為對(duì)照和二倍體煙草毛狀根再生植株的6.90倍和4.57倍。這表明采用毛狀根多倍體化可大大提高煙草植株的煙堿含量，從而獲得次生物質(zhì)含量更高的新種質(zhì)。

表2 多倍體與二倍體植株保衛(wèi)細(xì)胞大小、密度及其保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目的比較Table 2 Comparison of the size, density and number of chloroplasts of guard cells between polyploid and diploid plants

表3 煙草毛狀根多倍體誘導(dǎo)率Table 3 Induction rate of polyploid through polyploidization with hairy roots of N. tabacum

表4 煙草毛狀根多倍體再生植株煙堿含量的測(cè)定Table 4 Detection of nicotine content in polyploid hairy roots regenerated plants

3 討論

至今為止，應(yīng)用秋水仙素人工誘導(dǎo)染色體加倍來(lái)獲得植物多倍體新種質(zhì)已在莨菪Hyoscyamus niger[4]、丹參Salvia miltiorrhizaBge.[21]和可樂(lè)豆木Colophospermum mopane[22]等多種藥用植物以及百合Hemerocallis flavaL.[2]和仙客來(lái)Cyclamen persicum[23]等花卉植物中獲得成功。然而，在人工誘導(dǎo)植物多倍體時(shí)，大都用化學(xué)誘變劑秋水仙素處理植物的葉片[6]或愈傷組織[7]、根段[8]或生長(zhǎng)點(diǎn)[9]來(lái)進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)；極少見(jiàn)利用可自主生長(zhǎng)、單細(xì)胞起源的毛狀根作為倍性誘導(dǎo)起始材料的研究報(bào)道；也未見(jiàn)利用毛狀根多倍體化來(lái)獲得經(jīng)濟(jì)植物煙草毛狀根多倍體及其再生植株的研究報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，用秋水仙素處理煙草毛狀根不僅可獲得其毛狀根多倍體及其再生植株，而且所產(chǎn)生的多倍體易篩選，且多倍體誘導(dǎo)率也較高；這表明可自主生長(zhǎng)的毛狀根完全可用作人工多倍體誘變的良好起始材料。已有的研究表明，與原植物 (二倍體植株) 相比，由于染色體加倍，多倍體植株的農(nóng)藝性狀通常都有明顯的變化，突出表現(xiàn)在根、莖、葉和花等器官上具有“巨型性”，而產(chǎn)生出較大的營(yíng)養(yǎng)器官和繁殖器官[2-3,24]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，雖然不同植物多倍體的生理功能不一致，但通過(guò)物種的染色體數(shù)目加倍，大都能增強(qiáng)植物的次生代謝；導(dǎo)致多倍體植株通常都具有較高的次生物質(zhì)含量[4-5]；如懷牛膝Achyranthes bidentata同源四倍體藥用部位根干重顯著高于二倍體植株，而其主要次生物質(zhì)蛻皮激素的含量則較原植物高10倍之多[25]。而在本實(shí)驗(yàn)中，煙草毛狀根多倍體植株不僅在外形上具有巨型性，葉片葉色濃綠，葉片大而肥厚，莖桿粗壯，而且其多倍體再生植株中主要次生物質(zhì)煙堿含量也顯著提高，分別為毛狀根再生植株 (二倍體) 和對(duì)照 (野生植株) 的 4.57倍和6.90倍。此外，De Jesus-Gonzalez & Weathers等用秋水仙素誘導(dǎo)染色體加倍技術(shù)也獲得了青蒿素含量比其二倍體毛狀根高 6倍的同源四倍體青蒿Artemisia annuaL.毛狀根[12]；而這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果類(lèi)似。這表明，用單細(xì)胞起源、可自主生長(zhǎng)的毛狀根不僅可作為多倍體誘導(dǎo)的良好起始材料，而且通過(guò)其人工多倍體化還可以改變其生長(zhǎng)形態(tài)，大幅提高其次生物質(zhì)含量，達(dá)到創(chuàng)新其種質(zhì)和改良其植物性狀和品質(zhì)的育種目的。

以往的研究表明，在秋水仙素人工誘導(dǎo)多倍體時(shí)，其多倍體的誘導(dǎo)率高低與植物類(lèi)型、組織或器官特性以及秋水仙素的作用濃度和處理時(shí)間長(zhǎng)短等有關(guān)[24,26]。如張海鳳等[27]發(fā)現(xiàn)，以 0.1%秋水仙素處理杜仲Eucommia ulmoidesOliv.籽苗生長(zhǎng)點(diǎn)時(shí)，處理12 h后達(dá)到最佳誘變效果，其多倍體誘導(dǎo)率 36.7%；但同樣濃度的秋水仙素處理非洲菊Gerbera jamesonii叢生芽時(shí)，則以秋水仙素處理48 h的誘導(dǎo)效果最佳[26]。然而，在比較秋水仙素濃度和作用時(shí)間對(duì) 3種紫薇幼苗染色體加倍的效果時(shí)，0.5%和0.8%的秋水仙素處理紫薇Lagerstroemia indica和銀薇L. indica Linn. f. alba 48–96 h后，其植株多倍體誘導(dǎo)率均較高，其中以0.5%秋水仙素處理紫薇72 h的多倍體最高，達(dá)54.17%[28]。而這與本實(shí)驗(yàn)利用秋水仙素處理煙草毛狀根來(lái)進(jìn)行毛狀根多倍體誘導(dǎo)的結(jié)果不一致。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)采用不同濃度秋水仙素溶液進(jìn)行煙草毛狀根多倍體誘變處理時(shí)，其多倍體誘導(dǎo)的最適條件是0.1%的秋水仙素處理36 h，其毛狀根多倍體誘導(dǎo)率最高，約為64.71%。然而，用秋水仙素人工加倍處理獲得四倍體青蒿毛狀根時(shí)，則以0.25%或者0.5%的秋水仙素處理7 d的誘變效果最好，多倍體誘導(dǎo)率可達(dá)1%[12]。而這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不一致。這種差異的產(chǎn)生可能表明，秋水仙素人工誘導(dǎo)多倍體的效率高低或秋水仙素使用濃度高低可能與植物種類(lèi)、外植體類(lèi)型及其毛狀根的生長(zhǎng)特性等有關(guān)。

目前對(duì)植物多倍體的倍性鑒定最常用的方法是根尖細(xì)胞染色體倍性觀(guān)察和氣孔大小和形態(tài)等方法進(jìn)行鑒定[12,28]；但一些研究表明，以保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)為基礎(chǔ)的倍性鑒定也可作為一種快速、簡(jiǎn)便的倍性鑒定方法[29]。而在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)毛狀根根尖壓片觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)煙草二倍體植株的細(xì)胞染色體數(shù)為2n=48，而所產(chǎn)生的毛狀根多倍體再生植株為四倍體，其細(xì)胞染色體數(shù)為4n=96；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，煙草二倍體和四倍體植株葉片的保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目比值與其染色體數(shù)比一致，均為 1∶2；這也表明，以保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目多少也可作為鑒定煙草多倍體植株染色體倍性鑒定的快速而可靠的輔助方法。

已有的研究表明，發(fā)根農(nóng)桿菌 Ri質(zhì)粒的T-DNA(含有 4個(gè)生根基因 rolABCD的 T-DNA區(qū))片段在植物細(xì)胞核基因組中插入、整合及穩(wěn)定表達(dá)后所產(chǎn)生的可自主快速生長(zhǎng)毛狀根，不僅可用來(lái)生產(chǎn)植物的次生物質(zhì)[10-11]；同時(shí)，由于所產(chǎn)生的毛狀根能夠或很容易通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)再生出轉(zhuǎn)化植株[30-31]，因而也可用來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植株，用作植物種質(zhì)創(chuàng)新、新品種培育及性狀改良的有效工具；如能從毛狀根再生植株中篩選到表型正常 (即不出現(xiàn)通常的葉片皺縮轉(zhuǎn)化表型) 但花瓣顏色構(gòu)成發(fā)生變化的長(zhǎng)春花Catharanthus roseusL.[32]；或篩選到生長(zhǎng)習(xí)性和觀(guān)賞性狀發(fā)生變異的植株，如矮化、開(kāi)花習(xí)性發(fā)生改變 (如兩年生開(kāi)花植物變?yōu)橐荒晟_(kāi)花或每年開(kāi)花的植物) 的比利時(shí)菊苣Cichorium intybus和胡蘿卜轉(zhuǎn)化植株[33-34]；或利用含發(fā)根農(nóng)桿菌rolC基因的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得花期提早(前) 的碧冬茄Petunia hybrida植株[35]；或從毛狀根再生植株中獲得無(wú)需春化誘導(dǎo)即可成花的菊苣Cichorium intybusL.新品種[36]；或獲得其花冠形狀和株型改變的花卉植物高原龍膽Eustoma grandiflorum新株系[37]；或培育出更具優(yōu)良觀(guān)賞性狀的花卉植物紫高杯花Nierembergia scoparia毛狀根轉(zhuǎn)化植株[38]，達(dá)到改良和培育植物新品種或創(chuàng)新其種質(zhì)的目的。然而在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照相比，無(wú)論是二倍體煙草毛狀根再生植株，還是多倍體毛狀根再生植株也都能正常開(kāi)花和結(jié)果；但其植株開(kāi)花期均約比對(duì)照推遲21 d；這與Winefield等[35]僅用發(fā)根農(nóng)桿菌rolC基因?qū)Ρ潭堰z傳轉(zhuǎn)化獲得花期提早 (前) 的碧冬茄植株的結(jié)果不一致。而這種差異的產(chǎn)生可能與植株種類(lèi)、毛狀根類(lèi)型以及rol基因種類(lèi)等有關(guān)。而對(duì)于以收獲營(yíng)養(yǎng)器官為種植目的的煙草而言，本實(shí)驗(yàn)所獲得的開(kāi)花期較對(duì)照 (非轉(zhuǎn)化植株) 大幅推遲，也即營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期明顯延長(zhǎng)的煙草二倍體毛狀根再生植株和毛狀根多倍體再生植株，將可能具有提高煙草產(chǎn)量的潛力。

本文結(jié)果表明，可自主生長(zhǎng)的煙草毛狀根不僅可作為多倍體誘導(dǎo)的良好起始材料，而且能夠達(dá)到創(chuàng)新種質(zhì)和改良植物性狀和品質(zhì)的育種目的。為今后開(kāi)展利用煙草毛狀根多倍體再生植株來(lái)提高煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)以及利用毛狀根多倍體化來(lái)進(jìn)行植物種質(zhì)創(chuàng)新和性狀改良奠定了實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)。

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