重組白介素-2增強(qiáng)口蹄疫病毒多表位疫苗免疫效果研究

蘇春霞，段相國，陳溥言

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，寧夏銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)系，寧夏銀川 750004；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的反芻動(dòng)物的一種高度傳染性疾病，F(xiàn)MD在國際上被稱為“政治經(jīng)濟(jì)病”，主要是因?yàn)槠鋫鞑ニ俣瓤?，防控難度較大，而造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。目前，疫苗接種仍然是發(fā)展中國家控制FMD的一項(xiàng)重大策略［1-2］，但傳統(tǒng)的FMD疫苗存在不能區(qū)分疫苗接種與自然感染以及潛在的生物安全隱患等問題，因此，F(xiàn)MD新型疫苗如亞單位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗和重組病毒疫苗等被廣泛研究［3-4］。以往的研究表明，合成肽疫苗或重組蛋白疫苗能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生并能有效保護(hù)病毒對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的攻擊［5-6］，但這些疫苗的免疫原性不如傳統(tǒng)滅活疫苗。因此，研究者試圖通過增加抗原表位的數(shù)量或加入T輔助細(xì)胞表位等方法增強(qiáng)新型疫苗的免疫原性［7-8］。我們前期構(gòu)建了串聯(lián)表達(dá)FMDV多表位基因，同時(shí)引入通用型輔助性T淋巴細(xì)胞表位（PARDE）［9-10］，但其誘導(dǎo)小鼠抗體水平和細(xì)胞免疫應(yīng)答略低于滅活疫苗。很多研究者試圖利用細(xì)胞因子佐劑與FMD疫苗聯(lián)合免疫動(dòng)物，以增強(qiáng)后者的免疫原性。本研究通過聯(lián)合免疫表達(dá)豬IL-2的重組腺病毒（rAd5poIL-2）和串聯(lián)表達(dá)FMDV多表位的重組腺病毒（rAd5EGS），觀察IL-2對FMDV多表位疫苗誘導(dǎo)小鼠免疫功能的影響，為IL-2作為FMDV表位疫苗的候選佐劑提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)豬IL-2的重組腺病毒（rAd5poIL-2）、表達(dá)FMDV多表位重組腺病毒（rAd5EGS）、重組FMDV VP1蛋白由寧夏醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)系實(shí)驗(yàn)室保存；O型FMD滅活疫苗為中牧股份蘭州生物藥廠產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體為Caltag Laboratories公司產(chǎn)品；細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ檢測試劑盒為Raybiotech公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的分組與免疫接種 6周齡雌性Balb／c小鼠分為4組，每組12只，第1組聯(lián)合免疫rAd5poIL-2和rAd5EGS，第2、3和4組分別注射rAd5EGS、滅活疫苗和PBS，免疫劑量均為1×108TCID50／只，滅 活 疫 苗 和 PBS 組 分 別 注 射200μL，間隔2周免疫接種1次，共免疫接種3次。

1.2.2 脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 首次免疫接種后6周，參考文獻(xiàn)［7］采用MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖功能，簡述如下：無菌制備小鼠單個(gè)脾細(xì)胞懸液，接種到96孔板中，同時(shí)加入終濃度為10μg／mL的重組VP1蛋白，37℃培養(yǎng)44h，加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清，每孔加100μL DMSO，在微量振蕩器振蕩，用酶標(biāo)儀測570nm吸光度值。

1.2.3 抗體和抗體亞型檢測 分別于免疫接種后1周～6周尾靜脈采血，分離血清，常規(guī)ELISA檢測小鼠血清中抗VP1特異性IgG水平；首免后6周，ELISA檢測血清中IgG1和IgG2a抗體亞型水平［7］。

1.2.4 血清中IL-4和IFN-γ的測定 首次免疫接種后6周，定量ELISA檢測小鼠血清中IL-4和IFN-γ的表達(dá)水平，操作按Raybiotech公司試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad Prism5軟件，數(shù)據(jù)表示為D，方差分析或t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠特異性淋巴細(xì)胞增殖水平

首次免疫接種后6周，rAd5EGS能誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞增殖，但其誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖能力略低于滅活疫苗；rAd5poIL-2和rAd5EGS聯(lián)合免疫后，誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞增殖水平顯著高于單獨(dú)免疫rAd5EGS組（P＜0.01），而且聯(lián)合免疫組誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力也明顯高于滅活疫苗組（P＜0.05）；采用 Graphpad Prism5中的t檢驗(yàn)分析，結(jié)果見圖1。

2.2 特異性抗體和抗體亞型的檢測

ELISA結(jié)果顯示，rAd5EGS能刺激抗FMDV VP1特異性IgG的分泌，但其分泌水平低于滅活疫苗；rAd5poIL-2和rAd5EGS聯(lián)合免疫后能明顯提高小鼠血清中抗VP1特異性IgG的分泌水平，與單獨(dú)免疫rAd5EGS組相比，差異極顯著（P＜0.01），而且聯(lián)合免疫組誘導(dǎo)小鼠抗體分泌水平略高于滅活疫苗組，采用Graphpad Prism5中的方差分析，結(jié)果見圖2。IgG抗體亞型檢測結(jié)果表明，免疫接種后6周，rAd5EGS能刺激小鼠抗VP1特異性IgG1和IgG2a的分泌，與滅活疫苗相比，其誘導(dǎo)小鼠IgG2a的分泌水平略高；與單獨(dú)免疫rAd5EGS相比，聯(lián)合免疫rAd5poIL-2與rAd5EGS后，能明顯提高血清中IgG1和IgG2a的分泌（P＜0.05），采用Graphpad Prism5中的方差分析，結(jié)果見圖3。

圖1 小鼠淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)Fig.1 Mouse lymphocyte proliferation test

圖2 抗FMDV VP1特異性抗體IgG檢測Fig.2 Detection of anti-FMDV VP1specific IgG

2.3 小鼠血清中IL-4和IFN-γ的測定

首免后6周，rAd5EGS能誘導(dǎo)IL-4和IFN-γ的產(chǎn)生，但誘導(dǎo)IL-4的分泌水平低于滅活疫苗，rAd5poIL-2與rAd5EGS聯(lián)合免疫小鼠后能明顯增強(qiáng)rAd5EGS誘導(dǎo)IL-4和IFN-γ分泌的能力，差異極顯著（P＜0.01）；聯(lián)合免疫組誘導(dǎo)小鼠IL-4和IFN-γ分泌的能力也高于滅活疫苗組；采用Graphpad Prism5中的方差分析，結(jié)果見圖4。

圖3 抗VP1特異性抗體IgG亞型檢測Fig.3 Detection of specific VP1IgG subtypes

圖4 小鼠血清中IL-4和IFN-γ的水平Fig.4 Expression level of IL-4and IFN-γin mouse serum

3 討論

近年來，F(xiàn)MD新型疫苗的研究發(fā)展很快，但就表位疫苗或重組蛋白疫苗而言，其免疫效果依然不如傳統(tǒng)的滅活疫苗，因此，研究者試圖通過增加抗原表位或引入合適的輔助性T細(xì)胞表位以增強(qiáng)疫苗的免疫原性。我們前期通過Linker將O型FMDV的5個(gè)B細(xì)胞表位和2個(gè)T細(xì)胞表位基因串聯(lián)，同時(shí)引入PARDE，構(gòu)建重組腺病毒（rAd5EGS），小鼠免疫試驗(yàn)顯示rAd5EGS能誘導(dǎo)特異性抗體分泌與細(xì)胞免疫應(yīng)答，但其免疫原性略低于滅活疫苗［9-10］。在FMD疫苗設(shè)計(jì)策略中，細(xì)胞因子如干擾素，IL-2、IL-6、IL-15等常常被用于增強(qiáng)疫苗免疫效果［11-12］，其中IL-2是促進(jìn)T細(xì)胞生長的主要細(xì)胞因子，能促進(jìn)各種免疫效應(yīng)細(xì)胞的分化，包括T、B淋巴細(xì)胞，因此，在疫苗研究中，IL-2的應(yīng)用最為廣泛［13-14］。

機(jī)體抵抗FMDV感染過程中主要依賴于中和抗體發(fā)揮的體液免疫應(yīng)答，但細(xì)胞免疫應(yīng)答對清除病毒也是必不可少的。我們前期研究結(jié)果顯示，rAd5EGS免疫小鼠后誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答能力高于重組VP1疫苗，可見增加表位數(shù)量能明顯增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，但是rAd5EGS誘導(dǎo)小鼠特異性抗體產(chǎn)生的能力仍低于滅活疫苗［11］。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合免疫rAd5poIL-2和rAd5EGS后不但能提高疫苗誘導(dǎo)的抗體分泌水平，而且可以增強(qiáng)疫苗誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖能力，且免疫效果強(qiáng)于滅活疫苗。

在小鼠體內(nèi)，Th1型細(xì)胞會(huì)介導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG2a型抗體，Th2型細(xì)胞則會(huì)介導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG1型抗體。本研究中，rAd5EGS免疫小鼠后既能誘導(dǎo)IgG1的分泌，又能誘導(dǎo)IgG2a的分泌，與滅活疫苗相比，有促進(jìn)IgG2a分泌的優(yōu)勢，即促進(jìn)Th1免疫應(yīng)答；而聯(lián)合免疫rAd5poIL-2和rAd5EGS后能同時(shí)提高IgG1和IgG2a的分泌水平，與滅活疫苗組相比，聯(lián)合免疫組能明顯增強(qiáng)IgG2a的分泌水平，誘導(dǎo)IgG1的分泌水平略低于滅活疫苗組，但差異不顯著（P＞0.05）。

IFN-γ、IL-4分別是Th1和Th2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子。IL-4在體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用；IFN-γ在抗病毒感染方面起著非常重要的作用，IFN-γ水平是衡量FMD疫苗能否預(yù)防亞臨床感染的重要指標(biāo)。本研究中，rAd5EGS免疫小鼠后既能誘導(dǎo)IFN-γ的分泌又能誘導(dǎo)IL-4的分泌，但其誘導(dǎo)IL-4的能力低于滅活疫苗，而聯(lián)合免疫組能同時(shí)提高IFN-γ和IL-4的分泌水平，且誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌的能力高于滅活疫苗。

在小鼠體內(nèi)，Th1細(xì)胞亞群主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，Th2細(xì)胞亞群介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，本研究結(jié)果顯示rAd5EGS免疫小鼠后能明顯提高Th1免疫應(yīng)答，即促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答。聯(lián)合免疫rAd5poIL-2和rAd5EGS后能同時(shí)增強(qiáng)Th1和Th2免疫應(yīng)答，有效地調(diào)節(jié)了Th1和Th2的平衡，既促進(jìn)了細(xì)胞免疫應(yīng)答，又促進(jìn)了體液免疫應(yīng)答，為重組IL-2作為FMD重組疫苗佐劑的臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

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