hnRNP A1的增強(qiáng)型綠色熒光標(biāo)記及細(xì)胞應(yīng)激定位分析*

高星杰 宋 娟 葛 林 付 雪 孫曉明 張 緯何津巖 姚 智 楊 潔,△

hnRNP A1的增強(qiáng)型綠色熒光標(biāo)記及細(xì)胞應(yīng)激定位分析*

高星杰1宋 娟2葛 林2付 雪1孫曉明2張 緯2何津巖3姚 智4楊 潔1,2△

目的 構(gòu)建包含有核不均一核糖核蛋白（hnRNP）A1蛋白編碼區(qū)序列的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-hnRNP A1，并對增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記的hnRNP A1蛋白進(jìn)行細(xì)胞應(yīng)激共定位分析。方法提取HeLa細(xì)胞總RNA，以針對hnRNPA1-3′非翻譯區(qū)的特異性片段為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄出包含hnRNP A1編碼區(qū)序列的cDNA，并以其為模板，降落PCR法擴(kuò)增出帶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切位點(diǎn)的目的基因，利用雙酶切法分別酶切目的基因片段和線性pEGFP-C1，在T4-DNA連接酶的催化下將兩者連接構(gòu)建成pEGFP-C1-hnRNP A1重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞內(nèi)，以激光共聚焦熒光顯微鏡觀察EGFP-hnRNP A1的熒光表達(dá)情況，Western印跡法檢測EGFP與hnRNP A1的融合表達(dá)情況，最后進(jìn)行細(xì)胞原位雜交及細(xì)胞免疫熒光檢測在氧化應(yīng)激狀態(tài)下EGFP-hnRNP A1蛋白與poly(A)+mRNA（應(yīng)激顆粒的標(biāo)記成分）及DPC1a（加工體的標(biāo)記蛋白）的應(yīng)激共定位。結(jié)果以單/雙酶切及基因測序法鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒無誤，激光共聚焦熒光顯微鏡觀察和Western印跡結(jié)果檢測到綠色熒光融合蛋白的表達(dá)；EGFP-hnRNP A1蛋白與poly(A)+mRNA呈現(xiàn)共定位，但與DPC1a無共定位關(guān)系。結(jié)論重組pEGFP-C1-hnRNP A1質(zhì)粒成功構(gòu)建并表達(dá)，應(yīng)激狀態(tài)下EGFP標(biāo)記的hnRNP A1參與應(yīng)激顆粒的構(gòu)成。

核糖核蛋白類，核不均一；綠色熒光蛋白質(zhì)類；膜融合蛋白質(zhì)類；hnRNP A1蛋白；pEGFP-C1；融合蛋白；應(yīng)激顆粒

核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）A1是hnRNP蛋白家族中的重要一員。學(xué)者們已從不同角度探討hnRNP A1蛋白在選擇性剪接、mRNA代謝、端粒酶激活、凋亡調(diào)控等過程中的重要作用，然而從細(xì)胞水平探討hnRNP A1細(xì)胞應(yīng)激功能的相關(guān)研究尚少見[1-3]。本研究采用pEGFP-C1質(zhì)粒載體，旨在構(gòu)建pEGFPC1-hnRNP A1重組質(zhì)粒，在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)攜帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)簽的hnRNP A1蛋白，并進(jìn)行細(xì)胞應(yīng)激時的熒光定位分析，為深入研究多功能hnRNP A1蛋白的生物學(xué)功能提供便利工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞 pEGFP-C1載體購自美國Clontech公司；Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HeLa細(xì)胞為本實驗室保存。

1.1.2 試劑與儀器 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4 DNA連接酶均購自Fermentas公司；Taq酶購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司；T/A載體（pEASY-T1）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA快速凝膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司；質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖匈徸员本┧鱽韺毧萍加邢薰?；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。BCA蛋白測定試劑盒購自Pierce公司；單克隆鼠源抗EGFP抗體購自MBL公司；多克隆兔源抗DCP1a抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠源IgG二抗購自Fermentas公司；Alexa Fluor 546標(biāo)記的抗兔源IgG熒光二抗購自Invitrogen公司；LumiGLo化學(xué)發(fā)光底物購于KPL公司；DAPI染料購自Santa公司；TAMRA-oligo(dT)30購自生工生物工程公司；激光共聚焦皿購自NEST公司。激光共聚焦熒光顯微鏡（日本Olympus公司），引物合成及基因測序工作由北京天一輝遠(yuǎn)公司完成。

1.2 方法

1.2.1 獲取目的基因片段 培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，提取RNA，以“GTGAACTCAGCCAAG CACAGTGGT”為引物進(jìn)行hnRNP A1 cDNA的反轉(zhuǎn)錄，然后根據(jù)hnRNP A1的蛋白編碼區(qū)序列（NM_002136.2）設(shè)計含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物序列，上游:5′-CCGGAATTCCATGTCTAAGTCAGAGTCTCCTA-3′；下游:5′-CGCGGATCCTTAAAAT CTTCTGCCACTGCC-3′。再以含hnRNP A1序列的cDNA為模板，降落PCR擴(kuò)增目的片段，條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃30 s，65℃45 s，72℃3 min，每循環(huán)降低1℃，共15個循環(huán)，再以50℃進(jìn)行20個循環(huán)，72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段回收，在T4 DNA連接酶作用下，與pEASY-T1（T/A載體）25℃連接15 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐/卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴(kuò)增并提取質(zhì)粒。以EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，凝膠回收試劑盒回收并純化各目的片段。

1.2.2 線性pEGFP-C1的獲取 以質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖刑崛EGFP-C1質(zhì)粒DNA，進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，完整切下線性pEGFP-C1質(zhì)粒載體，1%瓊脂糖電泳分離。凝膠回收試劑盒回收得到約4 700 bp線性pEGFP-C1。

1.2.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-hnRNP A1的構(gòu)建 在T4 DNA連接酶作用下，將線性pEGFP-C1質(zhì)粒載體與具有相同黏性末端的hnRNP A1功能片段進(jìn)行22℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽性克隆，搖菌擴(kuò)增并提取重組質(zhì)粒。

1.2.4 單、雙酶切及基因測序鑒定 用EcoRⅠ和BamHⅠ對重組質(zhì)粒pEGFP-C1-hnRNP A1進(jìn)行單、雙酶切，并以1%瓊脂糖凝膠電泳驗證片段的大小。同時，對重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測序鑒定。

1.2.5 HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及熒光觀察 以去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取無內(nèi)毒素pEGFP-C1-hnRNP A1重組質(zhì)粒。HeLa細(xì)胞接種至激光共聚焦皿中，置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞80%匯合時，依據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48 h，加500 μL 1 g/L DAPI室溫避光孵育3 min，PBS洗滌3次，以激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光信號。

1.2.6 Western印跡檢測融合蛋白表達(dá) 分別轉(zhuǎn)染pEGFPC1-hnRNP A1重組質(zhì)粒及pEGFP-C1對照質(zhì)粒后48 h，先以預(yù)冷的1×PBS溶液洗滌轉(zhuǎn)染后HeLa細(xì)胞3次，加入預(yù)冷的1×NP-40裂解液裂解細(xì)胞，晃動培養(yǎng)板數(shù)次以確保裂解液完全覆蓋細(xì)胞，用無菌的細(xì)胞刮刮取細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1個1.5 mL Eppendorf管中，冰浴20 min。超聲破碎細(xì)胞后4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清獲得全細(xì)胞裂解液，以BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。裂解液中加入SDS上樣緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl pH6.8，2%SDS，0.1%溴酚藍(lán)，10%甘油，2.5% β-巰基乙醇），99℃熱變性5 min，進(jìn)行8%SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，以半干轉(zhuǎn)法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，鼠源抗人EGFP單克隆一抗4℃孵育過夜。TBST溶液洗膜4次，每次15 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠源IgG二抗室溫孵育2 h，TBST溶液再次洗膜4次，每次15 min。加入LumiGLo化學(xué)發(fā)光底物后暗室曝光。

1.2.7 原位雜交實驗 將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分為處理組與未處理組，處理組為0.5 mmol/L亞砷酸鹽處理1 h。以溫PBC洗滌3次，顯微鏡下觀察無死細(xì)胞及雜質(zhì)；4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，5 min/次；加500 μL 1 g/L DAPI室溫避光孵育3 min，PBS洗滌3次，5 min/次；加入1 mL含0.5%TritonX-100的PBS溶液，室溫靜置10 min；加入0.5 μmol/L TAMRA-oligo(dT)30，46℃濕盒雜交過夜。以含25%甲酰胺的0.5×SSC室溫洗滌3次，5 min/次；以4×SSC洗滌2次，5 min/次；以2× SSC洗滌1次，5 min；以1×SSC洗滌1次，5 min；加1 mL DEPC高壓水，最后以激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光信號。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.8 細(xì)胞免疫熒光實驗 轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-hnRNP A1重組質(zhì)粒后48 h，分為處理組（0.5 mmol/L亞砷酸鹽，1 h）與非處理組。4%多聚甲醛室溫固定10 min，加500 μL 1 g/L DAPI室溫避光孵育3 min，PBS洗滌3次，5 min/次；0.2%通透液（含0.2%Triton X-100的PBS）室溫靜置通透10 min；再加入1% BSA封閉1 h。加入多克隆兔源抗DCP1a（1∶100）的一抗4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，10 min/次。再加入Alexa Fluor 546標(biāo)記的抗兔源IgG熒光二抗（1∶800）4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，10 min/次。最后以激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光信號。每組實驗檢測50～100個細(xì)胞分別重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增目的片段 培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，提取RNA后針對hnRNP A1反轉(zhuǎn)錄出cDNA，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，結(jié)果在963 bp左右觀察到與目的片段長度相符的熒光條帶，見圖1。

Figure 1 Obtain of targeting hnRNP A1 fragment圖1 目的片段hnRNP A1的獲取

2.2 線性pEGFP-C1質(zhì)粒載體的獲取 EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切pEGFP-C1質(zhì)粒，切下完整的線性pEGFP-C1質(zhì)粒載體，見圖2。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在4 700 bp左右出現(xiàn)條帶，見圖3。純化回收后用于后續(xù)的連接反應(yīng)。

Figure 2 The map of pEGFP-C1 vector圖2 pEGFP-C1載體圖譜

Figure 3 Obtain of linear pEGFP-C1 vector圖3 線性pEGFP-C1質(zhì)粒載體的獲取

2.2.1 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-hnRNP A1的鑒定 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ的單、雙酶切，產(chǎn)生的條帶大小與預(yù)期相符，見圖4，重組質(zhì)?；驕y序結(jié)果也正確。

Figure 4 Single/double enzyme digestion of pEGFP-C1-hnRNP A1圖4 pEGFP-C1-hnRNP A1的單、雙酶切鑒定圖

2.2.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-hnRNP A1的熒光表達(dá) 激光共聚焦熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染的pEGFP-C1-hnRNP A1重組質(zhì)粒能夠表達(dá)EGFP-hnRNP A1，且主要在胞核中分布，見圖5。

2.2.3 Western印跡法檢測融合蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染有pEGFP-C1-hnRNP A1和pEGFP-C1的HeLa細(xì)胞，以針對EGFP的單克隆抗體分別檢測EGFP-hnRNP A1融合蛋白和EGFP的表達(dá)。hnRNP A1蛋白分子質(zhì)量為34.2 ku，EGFP為26.7 ku，兩者融合后為60.9 ku。Western印跡法檢測出與目的融合蛋白分子質(zhì)量相符的蛋白條帶，見圖6。

Figure 6 The data of Western blotting圖6 Western印跡結(jié)果

2.3 熒光共定位分析 將pEGFP-C1-hnRNP A1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞，激光共聚焦熒光顯微鏡下可見未處理組中EGFP-hnRNP A1主要分布于細(xì)胞核內(nèi)；當(dāng)給予0.5 mmol/L亞砷酸鹽氧化應(yīng)激處理時，EGFP-hnRNP A1與由TAMRA-oligo(dT)30探針標(biāo)記的poly(A)+mRNA可在胞漿中形成共同的應(yīng)激顆粒，見圖7，但與內(nèi)源性的DCP1a加工體顆粒無共定位關(guān)系，見圖8。

3 討論

生物體細(xì)胞所處環(huán)境復(fù)雜多變，經(jīng)常會受到氧化應(yīng)激、熱休克、紫外線照射、滲透壓休克和病毒感染等各種刺激。為適應(yīng)這些外界刺激，細(xì)胞也已進(jìn)化出多種應(yīng)激調(diào)節(jié)機(jī)制，其中最重要的是轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控機(jī)制。應(yīng)激顆粒與加工體便是真核細(xì)胞內(nèi)胞漿中存在的2種與細(xì)胞應(yīng)激mRNA代謝密切相關(guān)的顆粒結(jié)構(gòu)[4]。其中，應(yīng)激顆粒是真核細(xì)胞受到環(huán)境刺激時產(chǎn)生的顆粒狀結(jié)構(gòu)，由G3BP蛋白、翻譯起始因子eIF4E、RNA結(jié)合蛋白TIA-R以及poly(A)+mRNA等組成[4-5]。加工體則是細(xì)胞應(yīng)激時由脫帽行為（decapping）引發(fā)的降解mRNA的部位，包括5′→3′核酸外切酶、脫帽酶DCP1a、miRNAs、Argonaute1/2等[4,6]。

研究發(fā)現(xiàn)，hnRNP A1蛋白是一種重要RNA結(jié)合蛋白，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，可參與選擇性剪接等過程；當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激時，在p38信號通路介導(dǎo)下hnRNP A1蛋白會發(fā)生高度磷酸化，并穿梭至細(xì)胞漿中參與細(xì)胞應(yīng)激顆粒的構(gòu)成，增強(qiáng)細(xì)胞的生存能力[2]。另外，hnRNP A1可與HuR蛋白形成復(fù)合物，熱休克刺激會促進(jìn)該復(fù)合物出核并定位于細(xì)胞應(yīng)激顆粒[7]。當(dāng)細(xì)胞受到高滲應(yīng)激時，eIF2α蛋白發(fā)生磷酸化，也會導(dǎo)致hnRNP A1的胞漿分布以及應(yīng)激顆粒的形成，進(jìn)而可通過降低Bcl-xL mRNA的轉(zhuǎn)錄水平來促進(jìn)凋亡發(fā)生[3]。鑒于hnRNP A1蛋白在細(xì)胞應(yīng)激中的重要性，對于該蛋白的有效熒光標(biāo)記極為重要。EGFP是綠色熒光蛋白（GFP）的一個突變體，其熒光強(qiáng)度及光漂白抗性明顯增強(qiáng)，是迄今為止應(yīng)用最為廣泛的活體分子標(biāo)記物之一。本實驗即通過構(gòu)建pEGFP-C1-hnRNP A1重組質(zhì)粒的方法對hnRNP A1蛋白進(jìn)行EGFP熒光標(biāo)記。EGFP標(biāo)記的hnRNP A1蛋白在正常生理狀態(tài)時主要在胞核中分布，而當(dāng)細(xì)胞受到亞砷酸鹽氧化應(yīng)激時可與poly(A)+mRNA形成相同的應(yīng)激顆粒，但與內(nèi)源性DCP1a加工體顆粒并不存在共定位關(guān)系，表明以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的hnRNPA1可有效應(yīng)用于細(xì)胞應(yīng)激方面的研究。

hnRNP A1還與病毒感染、腫瘤、神經(jīng)性疾病等有關(guān)。例如，當(dāng)細(xì)胞感染水皰性口炎病毒時，hnRNP A1蛋白在Rae1蛋白的輔助下會出核并定位于應(yīng)激顆粒中[8]。hnRNP A1還可能通過細(xì)胞應(yīng)激環(huán)節(jié)參與肌萎縮側(cè)索硬化癥的發(fā)生、發(fā)展[9-10]。增強(qiáng)型綠色熒光標(biāo)記的hnRNP A1可用于細(xì)胞免疫熒光、活細(xì)胞工作站、光漂白恢復(fù)、免疫共沉淀等相關(guān)實驗，將有助于深入探究hnRNP A1蛋白在細(xì)胞應(yīng)激及相關(guān)疾病領(lǐng)域的生物學(xué)功能。

Figure 5 The expression of EGFP-hnRNPA1 via confocal fluorescence microscopy(bar=20 μm)圖5 激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒的表達(dá)(標(biāo)尺=20 μm)

Figure 7 Cellular co-localization analysis of EGFP-hnRNP A1 and poly(A)+mRNA(bar=10 μm)圖7 EGFP-hnRNP A1與poly(A)+mRNA的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激共定位分析(標(biāo)尺=20 μm)

Figure 8 Cellular co-localization analysis of EGFP-hnRNP A1 and DCP1a(bar=20 μm)圖8 EGFP-hnRNP A1與DCP1a的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激共定位分析(標(biāo)尺=20 μm)

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（2013-11-14收稿 2014-02-10修回）

（本文編輯 魏杰）

Cellular Localization Analysis of Enhanced Green Fluorescent Protein Tagged hnRNP A1 Under Stress

GAO Xingjie1,SONG Juan2,GE Lin2,FU Xue1,SUN Xiaoming2,ZHANG Wei2,HE Jinyan3,YAO Zhi4,YANG Jie1,2
1 Basic Medical College and Research Center;2 Department of Biochemistry;3 Department of physiology;4 Department of Immunology;Tianjin Medical University,Tianjin,300070,China

ObjectiveTo construct eukaryotic enhanced green fluorescent protein(EGFP)expressing recombinant plasmid,pEGFP-C1-hnRNP A1,which contains coding sequence of human hnRNP A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1),and to perform cellular localization analysis of EGFP tagged hnRNP A1 under stress.MethodsTotal RNA was isolated from HeLa cell used for synthesis of first-strand cDNAs using reverse primers that are specific for the3′-untranslated region of hnRNP A1.hnRNP A1 gene fragments were then amplified by touch-down PCR from those cDNAs and inserted into pEGFP-C1 fluorescent bearing vector through EcoRⅠ/BamHⅡdouble enzyme digestion and T4 DNA Ligase connection.The recombinant pEGFP-C1-hnRNP A1 plasmid was transfected into HeLa cells and green fluorescent tagged fusion proteins was examined by Western blot and confocal fluorescence microscopy.Co-localization of EGFP-hnRNP A1 with poly(A)+mRNA(the marker of the stress granules),or DCP1a(the marker of processome)were detected by RNA fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence.ResultsThe pEGFP-C1-hnRNP A1 was sequenced and digested correctly by restriction single/double enzyme.The green fluorescent fusion protein was also detected in transfected HeLa cell by Western blot and confocal fluorescence microscopy.EGFP-hnRNP A1 co-localizes with poly(A)+mRNA,but not DCP1a.ConclusionRecombinant eukaryotic plasmid of pEGFP-C1-hnRNP A1 was constructed successfully and expressed effectively.EGFP tagged hnRNP A1 takes part in forming stress granules.

heterogeneous-nuclear ribonucleoproteins;green fluorescent proteins;membrane fusion proteins; human hnRNP A1 protein;pEGFP-C1;fusion protein;stress granules

Q591.2,Q784

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.003

*國家自然科學(xué)基金資助項目（項目編號：31100967，31170830,31370749）；國家杰出青年基金項目（項目編號：31125012）

1天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心（郵編300070），2生化教研室，3生理教研室，4免疫教研室

△通訊作者 E-mail：yangj@tijmu.edu.cn