GDNF、GFRα1和RET在先天性直腸肛門畸形中的表達(dá)及意義*

張 輝 詹江華

GDNF、GFRα1和RET在先天性直腸肛門畸形中的表達(dá)及意義*

張 輝1詹江華2△

目的 探討神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、其受體GFRα1和原癌基因RET在先天性直腸肛門畸形腸壁組織中的表達(dá)及意義。方法收集經(jīng)手術(shù)治療的直腸肛門畸形患者12例，男8例，女4例，年齡3 d～2歲，高位無肛2例，中位無肛4例，低位無肛6例。采用免疫組織化學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分別檢測12例患兒腸壁盲端組織和距離盲端3 cm處的組織標(biāo)本中RET、GDNF和GFRα1的表達(dá)。結(jié)果高、中、低位無肛患兒盲端標(biāo)本中均缺乏神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，且RET、GDNF和GFRα1在盲端中均未見表達(dá)；距離盲端3 cm處，高、中、低位無肛組織中有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，存在RET、GDNF和GFRα1的表達(dá)，中、低位無肛組織中呈棕褐色為強(qiáng)陽性，而高位無肛呈淡黃色和棕黃色為弱陽性或者陽性；術(shù)后功能隨訪，高位無肛中1例出現(xiàn)污糞，1例出現(xiàn)稀便不能控制，無肛門失禁情況。中、低位無肛中有1例出現(xiàn)直腸黏膜脫出，經(jīng)坐浴肛門護(hù)理好轉(zhuǎn)，1例出現(xiàn)排氣時(shí)偶有污便，其余8例術(shù)后排便功能未見異常。結(jié)論先天性直腸肛門畸形患兒的直腸末端中神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF、GFRα1和RET的低表達(dá)可能與直腸肛門畸形術(shù)后排便功能不良關(guān)系密切。

肛門閉鎖；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子類；膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體；原癌基因蛋白質(zhì)cret；免疫組織化學(xué)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

先天性直腸肛門畸形術(shù)后常出現(xiàn)便秘和失禁，是困惑小兒外科醫(yī)生的問題之一。醫(yī)生時(shí)常通過改變手術(shù)方式試圖達(dá)到家長滿意的療效，但往往事與愿違，手術(shù)方式改變了，但是便秘和功能不良的情況依然存在。初步研究證實(shí)，直腸肛門畸形患兒常伴隨肛門周圍肌肉發(fā)育異常、神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)叢的減少或缺失，最終影響腸道排便功能，導(dǎo)致術(shù)后肛門功能不良，這些改變通常與神經(jīng)營養(yǎng)因子關(guān)系密切[1]。目前研究較多的神經(jīng)營養(yǎng)因子包括特異性烯醇化酶（NSE）、S-100、Cajal及神經(jīng)細(xì)胞黏附因子（NCAM）等[2]。但還有一些與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞功能表達(dá)密切相關(guān)的因子，包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、其受體GFRα1及原癌基因RET在直腸肛門畸形中表達(dá)的研究較少[3]。本研究通過觀察直腸肛門畸形患兒直腸盲端的神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，以期了解直腸盲端神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分布，以及此類神經(jīng)營養(yǎng)因子與新肛門功能之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例來源 選擇2009年1月—2012年12月在我院外科手術(shù)治療的直腸肛門畸形患者12例，其中男8例，女4例，手術(shù)時(shí)年齡3 d～2歲。12例中高位2例，中位4例，低位6例。手術(shù)方式分別采用腹腔鏡輔助肛門成形術(shù)，中低位無肛采用倒“Y”肛門成形術(shù)。圍手術(shù)期恢復(fù)順利，無相關(guān)合并癥發(fā)生，隨訪結(jié)果滿意。

1.2 手術(shù)標(biāo)本處理 所有患者在進(jìn)行肛門成形手術(shù)時(shí)，分別在直腸盲端和距離閉鎖盲端3 cm處留取標(biāo)本，其中新鮮標(biāo)本提取RNA逆轉(zhuǎn)錄后行PCR檢測相應(yīng)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)；另外石蠟包埋組織切片分別檢測神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分布情況，免疫組化檢測各類神經(jīng)營養(yǎng)因子在腸壁內(nèi)的表達(dá)情況。

1.3 免疫組化方法 標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片。免疫組化采用SP法，用已知陽性片做陽性對(duì)照，PBS代替一抗做陰性對(duì)照。所用RET、GDNF和GFRα1抗體為美國Zymed公司產(chǎn)品，工作濃度1∶50。過氧化物酶SP試劑盒及EDTA修復(fù)液購自北京中山生物技術(shù)公司。結(jié)果判定：以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。高倍鏡下隨機(jī)讀取每5個(gè)視野單位面積內(nèi)黏膜下神經(jīng)叢及肌間神經(jīng)叢數(shù)目，計(jì)數(shù)神經(jīng)叢內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） 分別選取直腸盲端和距離盲端3 cm處直腸組織，采用Trizol一步法提取試劑盒（Invitrogen,Paisley,UK）提取總RNA，經(jīng)RNeasy Column（Qiagen,Hilden,Germany）去除小片段，逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行PCR。引物序列見表1。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL，反應(yīng)條件：94℃，4 min，94℃，60 s，66℃，60 s，72℃，60 s；共30個(gè)循環(huán)，后延伸72℃，10 min。PCR產(chǎn)物使用2%添加EB的電泳膠進(jìn)行電泳。

Table 1 Primer sequences of RET,GFRα1 and GAPDH表1RET、GNDF、GFRα1及GAPDH引物序列

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)后肛門功能隨訪結(jié)果 本組患者均獲得隨訪，術(shù)后隨訪3個(gè)月～4年。2例高位無肛患者中1例出現(xiàn)污糞，1例出現(xiàn)稀便不能控制，無肛門失禁情況。中、低位無肛患者中1例出現(xiàn)直腸黏膜脫出，經(jīng)坐浴肛門護(hù)理好轉(zhuǎn)，1例出現(xiàn)排氣時(shí)偶有糞便排出情況。其余8例術(shù)后排便功能未見異常。

2.2 GDNF、GFRα1和RET蛋白表達(dá) HE染色顯示無論是高位、中位和低位無肛，直腸盲端均未見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，而在距離直腸盲端3 cm處取材的組織中可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，只是細(xì)胞數(shù)量不同。低位和中位無肛距離直腸盲端3 cm處可以見到數(shù)量和形態(tài)均正常的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，而高位無肛有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，但是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量少、形態(tài)小。

免疫組化染色顯示患者直腸盲端組織中均未見3種蛋白表達(dá)；距離直腸盲端3 cm處組織中可見3種蛋白表達(dá)，中、低位無肛3種神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)呈棕褐色為強(qiáng)陽性（+++），而高位無肛呈淡黃色和棕黃色為弱陽性或者陽性（+～++），見圖1；與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分布情況相一致。

2.3 RT-PCR結(jié)果 低位、中位和高位腸壁組織中存在內(nèi)參GAPDH的表達(dá)，GDNF、GFRα1、RET均是低位無肛表達(dá)最高，中位無肛表達(dá)次之，高位無肛表達(dá)最低，見圖2。

3 討論

目前先天性直腸肛門畸形是小兒外科比較常見的先天性發(fā)育畸形，文獻(xiàn)報(bào)道在新出生嬰兒中其發(fā)病率為1/1 500～1/5 000[4]。肛門直腸畸形的種類繁多，病理改變復(fù)雜，不僅肛門直腸本身發(fā)育缺陷，肛門周圍肌肉-恥骨直腸肌、肛門外括約肌和肛門內(nèi)括約肌均有不同程度的改變，腸道神經(jīng)系統(tǒng)改變也是重要病理改變。腸壁內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育依賴其神經(jīng)營養(yǎng)因子的支持和維護(hù)[5]。研究證實(shí)，在直腸肛門畸形腸壁組織中缺乏NSE、S-100和C-kit表達(dá)與肛門功能關(guān)系密切[2]。但是與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、遷移、定植功能密切相關(guān)的GDNF、GFRα1、RET的功能表達(dá)尚少見報(bào)道。RET和GDNF是腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育最重要的營養(yǎng)和信號(hào)傳輸系統(tǒng)，其存在預(yù)示神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可能在胚胎期發(fā)育成熟。如表達(dá)缺失則可能伴有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育過程受阻，引起其定植、遷移和成熟過程受阻。

Figure 2 PCR results of GDNF,GFRα1and RET transcription in tissue of congenital imperforate anus圖2 GDNF、GFRα1和RET在先天性直腸肛門畸形腸組織的PCR結(jié)果

GDNF及其家族是屬于糖蛋白，與RET結(jié)合緊密，本身具有獨(dú)特的信號(hào)傳輸途徑[6]。GDNF可抑制由RET基因引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且這一抑制過程在RET基因的5種突變中均可見到。GDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子，在體外研究中可見GDNF有促進(jìn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的作用。GFRα有4種形式，包括GFRα1～4，分別有相應(yīng)的受體。目前考慮，不僅GDNF/RET在腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育過程中有關(guān)鍵的作用，而且GDNF/GFRα1也具有非常重要的作用。在敲除RET后，可見GDNF單獨(dú)激活感覺神經(jīng)元的活性；同樣在RET基因缺失表達(dá)情況下，有GFRα1表達(dá)時(shí)，GDNF可以促進(jìn)神經(jīng)元的存活，說明GFRα1、GDNF可能還有另外一條途徑來影響神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育過程[7]，有待進(jìn)一步深入研究。所有GDNF參與的過程均可見GFRα1表達(dá)，提示GDNF和GFRα1不斷釋放激動(dòng)信號(hào)，通過RET基因傳遞到神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)，以維持神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活、發(fā)育和移行過程。本研究結(jié)果證實(shí)，在有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存在的腸壁內(nèi)，均存在GDNF、GFRα1、RET表達(dá)。

Maurício等[8]研究顯示ARM小鼠模型可見腸道末端神經(jīng)節(jié)細(xì)胞密度降低，且功能表達(dá)也有所降低；在術(shù)中保留的腸管末端是否存在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育不良或神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺乏，與其預(yù)后密切相關(guān)。腸道組織活檢病理檢測神經(jīng)節(jié)密度、神經(jīng)節(jié)大小、神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量及大小可以客觀反映腸道功能，評(píng)價(jià)術(shù)后生存質(zhì)量[9]。根據(jù)直腸末端神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及神經(jīng)叢殘留情況，可以估計(jì)保留腸管是否具有正常腸道功能，是否支持患兒術(shù)后腸道正常運(yùn)動(dòng)，以指導(dǎo)術(shù)式選擇、腸管保留，并對(duì)評(píng)價(jià)患兒預(yù)后具有重要作用[10]。

本組研究結(jié)果顯示中、低位無肛腸壁中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)高于高位無肛組織，RT-PCR結(jié)果亦得出同樣結(jié)論，提示患兒神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的先天發(fā)育存在異常。在高位無肛患兒腸壁內(nèi)發(fā)育成活的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量少、形態(tài)小。RET、GDNF、GFRα1在腸壁內(nèi)的表達(dá)情況與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分布情況相對(duì)應(yīng)，有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存在的腸壁內(nèi)，免疫組化染色呈現(xiàn)陽性表達(dá)，而在直腸末端其表達(dá)明顯減低，推測在腸壁內(nèi)RET、GDNF、GFRα1的表達(dá)情況與其神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分布多少成正比。中、低位無肛神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)明顯好于高位無肛；結(jié)合臨床的隨訪結(jié)果，提示直腸末端神經(jīng)營養(yǎng)因子的低表達(dá)可能與直腸肛門畸形術(shù)后排便功能不良關(guān)系密切。高位無肛術(shù)后肛門功能不良與神經(jīng)營養(yǎng)因子的分布降低是否有關(guān)還需大樣本研究來證實(shí)。在高位無肛的手術(shù)過程中，應(yīng)注意結(jié)合臨床和病理檢查結(jié)果決定保留其直腸末端的腸管組織，以便術(shù)后獲得良好的直腸肛門功能。

Figure 1 Protein expressions of GDNF,GFRα1 and RET圖1 GDNF、GFRα1和RET蛋白表達(dá)（SP染色，×400）

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（2013-11-04收稿 2014-04-17修回）

（本文編輯 李國琪）

Clinical Significance of GDNF/GFRα1/RET Expression in Distal Rectum with Congenital Anorectal Malformation

ZHANG Hui1,ZHAN Jianghua2
1 Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Department of Surgery, Tianjin Children’s Hospital

Objective To evaluate the significance and expression of the GDNF/GFRα1/RET genes in distal rectum with Congenital Anorectal Malformations(ARMs)MethodsSpecimens were collected from resected colon which is 3 cm away to the anus and the distal of rectum in 12 ARMs patients.Haematoxylin and Eosin(HE)staining,immunohistochemical (IHC)staining and reverse transcription PCR(RT-PCR)were used to test RET,GDNF and GFRα1 expression in the different site of samples with ARMs.ResultsExpression of ganglia and RET,GDNF and GFRα1 were all negative in distal rectum in 12 ARMs patients.Ganglionic cells were found in tissues 3 cm away from the anus where RET,GDNF and GFRα1 expression were also positive in those ARMs patients.Expression of RET,GDNF and GFRα1 were strong positive in middle and low imperforate anus indicated by brown color and week positive in high imperforate anus indicated by yellow color.One case of faeces contamination and one case of loose motion without anal incontinence were found in post-op follow up of high ARMs patients.By contrast,one case of rectal mucosa prolapse and one case of occasional faeces contamination which recovered with hip bath were found in post op follow up in middle or low ARMs.ConclusionThe unsatisfactory anorectal function is possibly related to the decrease or lost of neurotrophic factors(GDNF/GFRα1/RET)and ganglia in the myenteric plexuses post plastic surgery in ARMs patients.

anus imperforate;glial cell line-derived neurotrophic factors;glial cell line-derived neurotrophic factor receptors;proto-oncogene proteins c-ret;immunohistochemistry;reverse transcriptase polymerase chain reaction

R657.11

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.023

*天津市科委計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：10JCYBJC11400）

1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（郵編300070）；2天津市兒童醫(yī)院普外科

△通訊作者 E-mail:zhanjianghuatj@163.com