強力霉素對胃癌細胞增殖及Notch1、MMP-9表達的影響*

許 敏 李 紅

強力霉素對胃癌細胞增殖及Notch1、MMP-9表達的影響*

許 敏 李 紅△

目的 研究強力霉素對胃癌細胞BGC-823細胞的增殖及Notch1、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白表達的影響，為胃癌的治療提供新的抗腫瘤藥物。方法分別以0、5、10、20、40 mg/L終濃度的強力霉素作用于人胃癌細胞系BGC-823，運用MTT法檢測細胞增殖程度；流式細胞儀檢測細胞周期分布的影響；Western Blot檢測Notch1、MMP-9蛋白水平的表達。結(jié)果強力霉素能夠抑制人胃癌細胞BGC-823細胞的增殖，且有劑量及時間依賴性（P＜0.01）；強力霉素能夠改變胃癌細胞BGC-823周期的分布，隨著濃度的增加，S期所占比例降低；并且隨著濃度的增加，Notch1的表達增強，MMP-9的表達降低（P＜0.01）。結(jié)論強力霉素能夠抑制胃癌細胞BGC-823的增殖，促進Notch1上調(diào)為可能的機制之一。

胃腫瘤；細胞系,腫瘤；受體,Notch1；基質(zhì)金屬蛋白酶9；細胞增殖；細胞周期；強力霉素

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均較高，迫切需要尋找新的治療方法。強力霉素是一種長效類四環(huán)素類抗生素，近年來發(fā)現(xiàn)強力霉素不但能夠抑制細菌蛋白質(zhì)的合成，還是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的有效抑制劑，并且已經(jīng)被應(yīng)用于多種癌細胞的研究[1-2]。Notch信號通路作為一種進化保守的細胞間相互作用機制，在細胞的增殖和分化中起重要作用，與胃癌的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系[3]。本研究觀察強力霉素對人胃癌細胞系BGC-823細胞的增殖、細胞周期及Notch1、MMP-9表達的影響，初步探討其可能的機制，為強力霉素治療胃癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人胃癌細胞株（BGC-823）由北京大學(xué)郁衛(wèi)東老師饋贈。實驗根據(jù)強力霉素濃度不同分為5組，分別為空白對照組，藥物終濃度為5、10、20、40 mg/L組。

1.2 主要試劑 強力霉素（sigma公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），培養(yǎng)基（美國GiBico公司），青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶（華美生物工程有限公司），Notch1抗體（ABCAM公司），MMP-9抗體（武漢博士德生物工程有限公司），二甲基亞砜（DMSO，Amresco公司），噻唑藍（MTT，Amresco公司），PI染色液，70%乙醇，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) BGC-823細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中（100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素），在37℃、體積分數(shù)為5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)進行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 藥物對細胞增殖作用的測定 采用MTT法。將細胞濃度調(diào)整為每孔細胞數(shù)為4×104，每孔200 μL，接種于96孔板，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。過夜后，分別加入含有不同濃度強力霉素的培養(yǎng)液，終濃度分別為5、10、20、40 mg/L，對照組加入相同體積的培養(yǎng)液，每一濃度設(shè)6個復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。實驗結(jié)束前4 h，每孔加入MTT溶液（5 g/L）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩15 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上，以波長570 nm測定各孔吸光度（A）值。強力霉素對細胞生長的抑制率（IR）=（1-實驗組A570nm/對照組A570nm）× 100%。以時間為橫軸，抑制率為縱軸繪制生長曲線，觀察強力霉素對BGC-823細胞增殖的影響。

1.3.3 細胞周期分布檢測 取對數(shù)生長期細胞，以不同濃度強力霉素作用于細胞，對照組加入相同體積的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，收集各組細胞，離心后PBS洗2遍，每管加入70%乙醇1 mL，將細胞輕輕吹起。4℃固定12 h，離心、棄固定液，用PBS重懸細胞后轉(zhuǎn)入流式管，再次離心、棄上清，將每管中加入PI染色液，室溫避光染色15 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3.4 Notch1和MMP-9蛋白表達測定 采用Western Blot法。以不同濃度強力霉素作用于細胞，對照組加入相同體積的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，各組細胞中加入細胞裂解液RIPA，提取出細胞總蛋白，蛋白量根據(jù)Lowery法進行測定。以每個樣品50 μg總蛋白的量準確點樣，進行電泳，轉(zhuǎn)膜。用含2%胎牛血清白蛋白（BSA）的Tris緩沖鹽溶液（TBST）封閉2 h，加入一抗兔抗人Notch1 IgG（1∶1 000），兔抗人MMP-9 IgG（1∶100），4℃孵育過夜，用TBST洗膜3次，加入HRP標記的二抗羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫下水平搖動2 h，洗膜3次，用化學(xué)發(fā)光法（ECL）進行顯色，曝光。以β-Actin抗體作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及重復(fù)測量資料的方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，相關(guān)性比較采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 強力霉素對細胞增殖能力的影響 在一定范圍內(nèi)，不同濃度、不同時間的強力霉素組處理后均對胃癌細胞的生長起抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F分組=22.050，F(xiàn)時間=617.376，F(xiàn)交互=40.552，均P＜0.001），且隨著濃度的升高和作用時間的增強，其抑制作用加強，即強力霉素抑制胃癌細胞BGC-823呈時間、劑量依賴關(guān)系，見圖1。

2.2 強力霉素對細胞周期的影響 強力霉素作用于胃癌細胞48 h后，5、10、20、40 mg/L組G0/G1期比例較對照組逐漸增加，而S期和G2/M期比例下降（P＜0.05）。強力霉素可將BGC-823細胞阻滯于G0/ G1期，抑制細胞進入S期和G2/M期，見表1。

Figure 1 The inhibitory effect of doxycycline on BGC-823 cell line圖1 強力霉素對BGC-823細胞的抑制效應(yīng)

Table 2 Effect of different concentrations of doxycycline on cell cycle distribution表1 不同濃度強力霉素作用48 h后細胞周期分布檢測結(jié)果 （n=6，%±s）

Table 2 Effect of different concentrations of doxycycline on cell cycle distribution表1 不同濃度強力霉素作用48 h后細胞周期分布檢測結(jié)果 （n=6，%±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，d與（4）組比較，P＜0.05

組別對照組（1）強力霉素5 mg/L組（2）強力霉素10 mg/L組（3）強力霉素20 mg/L組（4）強力霉素40 mg/L組（5）F G0/G1期38.23±0.33 47.85±0.58a56.51±0.46ab62.25±0.57abc67.06±0.62abcd892.530＊＊S期31.56±0.41 24.83±0.62a18.46±0.48ab15.72±0.37abc12.37±0.56abcd949.002＊＊G2/M期30.21±0.61 27.32±0.57 25.03±0.66a22.03±0.61ab20.57±0.72abc139.190＊＊

2.3 Notch1和MMP-9蛋白表達 不同濃度強力霉素作用胃癌細胞48 h后，在一定范圍內(nèi)隨著強力霉素濃度增加，Notch1的表達增強，MMP-9的表達降低，見表2、圖2。Notch-1與MMP-9表達呈負相關(guān)（r=-0.994,P＜0.05）。

Table 2 The Expression of Notch1 and MMP-9表2Notch1和MMP-9蛋白表達結(jié)果（n=6±s）

Table 2 The Expression of Notch1 and MMP-9表2Notch1和MMP-9蛋白表達結(jié)果（n=6±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，d與（4）組比較，P＜0.01

組別對照組（1）強力霉素5 mg/L組（2）強力霉素10 mg/L組（3）強力霉素20 mg/L組（4）強力霉素40 mg/L組（5）F Notch1 0.407 2±0.003 0 0.514 5±0.002 6a0.625 3±0.002 5ab0.682 6±0.003 6abc0.736 8±0.002 3abcd6 661.907＊＊MMP-9 0.937 8±0.003 1 0.825 6±0.002 7a0.633 4±0.003 2ab0.518 3±0.003 3abc0.434 6±0.003 4abcd13 419.911＊＊

3 討論

3.1 強力霉素的作用機制 近年來，強力霉素的非抗菌作用得到了較多研究，已應(yīng)用于腫瘤[1-2]、骨關(guān)節(jié)炎[4]和動脈粥樣硬化治療[5]等多方面。強力霉素是MMPs的有效抑制劑。MMPs是一種鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，其中，MMP-9是MMPs中分子質(zhì)量最大的酶，可降解基底膜，為血管內(nèi)皮細胞的遷移和新生血管的延伸創(chuàng)造了必要條件，進而導(dǎo)致腫瘤的生長和擴散[6]。目前，強力霉素抑制MMPs的機制并不是十分清楚，有研究認為可能與強力霉素的Ca2+、Zn2+結(jié)合能力有關(guān)，其通過形成螯合物消除了MMPs的催化活化位點，從而抑制MMPs[7]。

Figure 2 Effect of different concentrations of doxycycline on Notch1 and MMP-9 expression圖2 不同濃度強力霉素對Notch1和MMP-9表達的影響

3.2 Notch1信號通路的可能作用機制 Notch信號通路的錯誤調(diào)節(jié)可引起人體較大范圍的障礙，包括發(fā)育綜合征、癌癥[8]等。該信號通路有4種受體（Notch1～4）和5種配體（Jagged1、Jagged2、Deltalike1、Delta-like3、Delta-like4），其中Notch1與Jagged1為最重要的受體和配體。Notch1的胞外域與Jagged1結(jié)合后可促進Notch1胞內(nèi)活性域NICD釋放，NICD進入核內(nèi)后誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄。趙娜等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Notch1低表達可能誘導(dǎo)核因子（NF）-κB高表達，進而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。并且通過對MMPs基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在MMPs基因啟動子近端調(diào)控區(qū)有特異性的NF-κB結(jié)合位點，去除NF-κB結(jié)合位點后可使MMPs表達降低[10]。

3.3 強力霉素通過Notch信號通路抑制胃癌細胞增殖可能性機制 本實驗發(fā)現(xiàn)強力霉素對胃癌細胞的生長具有明顯的抑制作用，并且具有時間、濃度依賴性，這與謝兆蘭等[11]的報道一致；不同濃度強力霉素作用胃癌細胞48 h后，隨著濃度的增加，強力霉素可以上調(diào)Notch1蛋白的表達，抑制MMPs的表達，因此推測強力霉素可能通過促進Notch信號通路來抑制NF-κB的表達，從而進一步抑制MMPs的表達來發(fā)揮抗癌作用。

本研究似可為胃癌治療提供新的可能方法，然而將四環(huán)素類MMPs抑制劑應(yīng)用于胃癌的臨床治療仍舊有很長的路需要探索。

[1]Wang H,Xu Y,Fang Z,et al.Doxycycline regulated induction of AKT in murine prostate drives proliferation independently of p27 cyclin dependent kinase inhibitor downregulation[J].PLoS One, 2012,7（7）:413-430．doi:10.1371/journal.pone.0041330.

[2]Ferreri AJ,Govi S,Pasini E,et al.Chlamydophila psittaci eradication with doxycycline as first-line targeted therapy for ocular adnexae lymphoma:final results of an international phase II trial[J].J clin Oncol,2012,30（24）:2988-2994．doi:10.1200/JCO.2011.41.4466.

[3]默娟,李紅.Notch1信號通路對胃癌細胞增殖的影響[J].山東醫(yī)藥,2012,52（7）:15-17.doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2012.07.006.

[4]Gibson MB，Hashimoto K，Roach HI,et al.Progression of cartilage degradation in osteoarthritis may involve autocrine induction of IL-1 beta and loss of DNA methylation[J].J Bone Joint Surg Br Proceedings，2009,5（91）：292．

[5]Jawien J,Toton-Zuranska J,Kus K,et al.The effect of AVE 0991, nebivolol and doxycycline on inflammatory mediators in an apoE-knockout mouse model of atherosclerosi[J].Med Sci Monit,2012,18（10）:BR389-BR393.doi:10.12659/MSM.883478.

[6]Cho YB,Lee WY,Song SY,et al.Matrix metallopmteinase-9 activity is associated with poor prognosis in T3-T4 node-negative colorectal cancer[J].Hum Pathol,2007,38（11）:1603-1610.doi:10.1016/j. humpath.2007.03.018.

[7]王麗婭,徐明娟,吳薇,等.多西環(huán)素抗腫瘤作用機制的研究進展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2012（8）:14-16.doi:10.3969/j.issn.1673-548X.2012.08.006.

[8] Kopan R,Llagan MX.The canonical Notch signaling pathway:unfolding the activation mechanism[J].Cell,2009,137（2）:216-233. doi:10.1016/j.cell.2009.03.045.

[9] 趙娜,周梅愷,葉玉偉,等.胃癌組織中Notchl、Jaggedl及NF-κB的表達及臨床意義[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，32（8）:1061-1065．

[10]Parodi FE,Mao D,Ennis T,et al.Suppression of experimental abdominal aortic aneurysms in mice by treatment with pyrrolidine dithiocarbamate,an antioxidant inhibitor of nuclear factor-kappaB[J].J Vasc Surg，2005，41（3）:479-489．doi:10.1016/j.jvs.2004.12.030.

[11]謝兆蘭,朱尤慶,林小玲,等.強力霉素對胃癌細胞SGC-7901基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白組織抑制因子-2表達的影響[J].胃腸病學(xué)，2006，11（4）:202-206.doi:10.3969/j.issn.1008-7125. 2006.04.004.

（2013-11-08收稿 2014-02-14修回）

（本文編輯 李鵬）

Effect of Doxycycline on Gastric Cancer Cell Proliferation and Notch1,MMP-9 Expression

XU Min，LI Hong
Department of Biochemistry,Liaoning Medical College,Jinzhou,Liaoning 121000,China

ObjectiveTo investigate the effect of Doxycycline on gastric cancer cell line BGC-823 proliferation and Notch1,Matrix metalloproteinase-9（MMP-9）expression in order to shine a light on new anticancer drugs.MethodsFinal concentration of 0,5,10,20,40 mg/L doxycycline were added into human gastric cancer cell line BGC-823.Cell proliferation was detected by MTT;Cell cycle distribution was assessed by flow cytometry;Notch1,MMP-9 protein expression was revealed by Immunoblot.ResultsDoxycycline can inhibit proliferation of human gastric cancer cells line BGC-823, and its effect is dose and time-dependent（P＜0.01）.Doxycycline alters distribution of gastric cancer cell line BGC-823. With increasing drug concentration,the proportion of cells in S phase dropped（P＜0.01）.Notch1 expression rose and MMP-9 expression decreased（P＜0.01）.ConclusionDoxycyclinecan inhibited gastric cancer cell line BGC-823 proliferation and up-regulating Notch1 might be one mechanisms.

stomach neoplasms；cell line,tumor；receptor,Notch1；matrix metalloproteinase 9；cell proliferation；cell cycle；DOXYCYCLINE

R735.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.006

*遼寧省自然科學(xué)基金資助項目（項目編號：201102125）

遼寧錦州，遼寧醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室（郵編121001）

△通訊作者 E-mail：jzmu-lihong@sina.com