淋巴細(xì)胞免疫療法治療習(xí)慣性流產(chǎn)的療效及機制研究*

張業(yè)霞 李 睿 高 華 張佳倫 房震亞

(1.菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校病原教研室，山東 菏澤 274000；2.曹縣第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 曹縣 274400；3.菏澤市立醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 菏澤 274030)

習(xí)慣性流產(chǎn)是指連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn)，是女性妊娠期常見并發(fā)癥，其病因復(fù)雜，涉及遺傳、免疫、解剖、內(nèi)分泌、感染及胚胎畸形等多種因素，但仍有40%～60%為原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。近年來的研究表明，大部分URSA可能與免疫異常有關(guān)，約80%的URSA患者存在封閉抗體(blocking antibody，BA)缺乏[1]。近年來國內(nèi)外部分醫(yī)院開始探討用丈夫血淋巴細(xì)胞治療不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)，但經(jīng)免疫治療后封閉抗體產(chǎn)生與否、與妊娠結(jié)局之間有無相關(guān)性,不同學(xué)者觀點各異[2]。為進(jìn)一步探討丈夫血淋巴細(xì)胞免疫治療習(xí)慣性流產(chǎn)的療效及其與封閉抗體之間的關(guān)系，本研究特選60例封閉抗體陰性不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)病例進(jìn)行免疫學(xué)治療，探討封閉抗體與妊娠結(jié)局之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源 選擇2009-2012年菏澤市各醫(yī)院封閉抗體陰性不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)病例60例，患者年齡22～37歲，平均27.2歲，流產(chǎn)次數(shù)3～ 6次，平均3.8次，所有患者均符合免疫治療條件。①連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn)。②夫妻ABO、Rh血型相合，女方封閉抗體檢測陰性；③夫妻染色體核型正常；④丈夫精液常規(guī)正常；⑤女方無生殖道畸形與感染、遺傳疾病、自身免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病等；⑥丈夫肝、腎功能正常，無肝炎、HIV、梅毒等傳染病。經(jīng)過確切診斷后,對患者進(jìn)行充分的解釋和說明，讓夫妻雙方對免疫治療有一定的了解和認(rèn)識，對醫(yī)生具有充分的信任感，在治療過程中能保持良好心態(tài)，自愿積極配合治療并簽署知情同意書。另選40例封閉抗體陰性患者作為對照，采用常規(guī)方法保胎治療，兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異。

1.2方法

1.2.1封閉抗體檢測 用ELISA法進(jìn)行測定，分別于免疫治療前后對患者血清進(jìn)行封閉抗體檢測，試劑來自北京索奧生物技術(shù)有限公司，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書完成。

1.2.2免疫治療方法 無菌抽取丈夫肘靜脈血20～30 ml,肝素抗凝,常規(guī)分離、濃縮提取淋巴細(xì)胞,每次注射細(xì)胞數(shù)( 2～3)×107個/ml，以類似青霉素皮試方法少量多次于妻子前臂掌側(cè)皮內(nèi)注射 5個皮丘,每個皮丘 0.2 ml，連續(xù)注射3次，每次間隔2周,即為一療程。一般2個療程，即孕前注射3次,在接受治療的過程中，夫妻要避孕，一療程結(jié)束后復(fù)查封閉抗體，陽轉(zhuǎn)后鼓勵患者盡早妊娠,發(fā)現(xiàn)懷孕后再注射3次,進(jìn)行一療程的鞏固治療，直至度過危險期；如封閉抗體仍為陰性則繼續(xù)加強下一療程的免疫治療，直至封閉抗體轉(zhuǎn)陽后再考慮受孕。治療后6個月以上未妊娠者,再給予3～4次加強免疫盡量讓其懷孕,對孕期治療3次后仍有先兆流產(chǎn)癥狀的患者,再增強治療2～4次。注射時間避開月經(jīng)期或其他疾病急性期。每次治療均按無菌操作進(jìn)行，囑患者妊娠后注意休息，避免早期頻繁性生活，適當(dāng)心理疏導(dǎo)以減輕精神壓力，并認(rèn)真觀察妊娠早期反應(yīng)。所有患者均建立檔案, 定期回訪。

1.2.3T細(xì)胞亞群及IgG、IgM檢測 流式細(xì)胞術(shù)分析外周血T細(xì)胞亞群及IgG、IgM。嚴(yán)格按說明書要求完成標(biāo)本采集、免疫熒光染色、標(biāo)記、分析等各項操作。

1.2.4療效判定 妊娠成功標(biāo)準(zhǔn)為成功分娩或妊娠3個月以上且B超檢查無異常。

1.3數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 15.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者分別治療后妊娠結(jié)局分析 試驗組經(jīng)免疫治療后妊娠成功率為81.7%，其中成功分娩26人，正在妊娠中23人，再次流產(chǎn)11人。而對照組經(jīng)常規(guī)保胎治療妊娠成功率只有37.5%，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

表1 兩組患者治療后妊娠結(jié)局分析

注：兩組成功率比較，χ2=18.45，P<0.01。

2.2試驗組免疫治療后封閉抗體陽性與陰性者妊娠結(jié)局分析 試驗組60例患者經(jīng)免疫治療后，封閉抗體轉(zhuǎn)陽數(shù)為51人，其中再次流產(chǎn)者5人，妊娠成功率90.3%；封閉抗體仍為陰性者9人，再次流產(chǎn)6人，妊娠成功率33.3%。封閉抗體陽性組與陰性組妊娠成功率有統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=16.52，P<0.01)。

2.3試驗組免疫治療前后T細(xì)胞亞群及IgG、IgM檢測結(jié)果 結(jié)果顯示，患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群有了明顯變化。CD4+T細(xì)胞較治療前下降，CD8+T細(xì)胞治療后明顯上升，CD4+T/CD8+T下降，IgG與IgM治療后亦下降明顯，各項指標(biāo)免疫治療前后均有顯著性差異(見表2)。

表2 試驗組免疫治療前后T細(xì)胞亞群及IgG、IgM檢測結(jié)果

2.4注射部位皮膚反應(yīng) 密切觀察患者注射局部皮膚反應(yīng)，有無紅腫硬結(jié)、水泡等。

3 討 論

胚胎基因一半來自父方，一半來自母方，從免疫學(xué)觀點看，妊娠是一個復(fù)雜的生理過程，胚胎是一個半非己的同種異體移植物，因此原因不明的習(xí)慣性流產(chǎn)可能與免疫排斥反應(yīng)有關(guān)。近年研究表明，組織相容性抗原(HLA)在移植免疫中占有重要地位，夫妻間HLA抗原位點相似度越高，流產(chǎn)率越高，尤其是以DR抗原相似頻率越高的流產(chǎn)幾率越大[3]。在正常妊娠女性中, 由于夫妻間HLA抗原的非相容性, 胎兒所攜帶的位于滋養(yǎng)層細(xì)胞表面的父系HLA抗原能刺激母體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答, 妊娠婦女體內(nèi)產(chǎn)生一種抗丈夫淋巴細(xì)胞的特異性IgG 抗體, 此種抗體即封閉抗體，它既可阻止母體免疫系統(tǒng)對胚胎組織發(fā)生排斥反應(yīng), 封閉母體淋巴細(xì)胞對胎盤滋養(yǎng)層的細(xì)胞毒作用，防止Th細(xì)胞識別胎兒抗原，阻斷母體Tc細(xì)胞對胚胎的殺傷，保護(hù)胎兒、使妊娠正常維系，成為妊娠繼續(xù)所必需的保護(hù)傘，又能與胚胎細(xì)胞上的抗原結(jié)合，阻斷母體淋巴細(xì)胞到胚胎細(xì)胞的通路，使胚胎免受攻擊，此外封閉抗體還可保護(hù)和刺激胎盤細(xì)胞的生長與分化，促進(jìn)胚胎發(fā)育[4-6]。當(dāng)夫妻HLA抗原高度相似時, 母體的免疫應(yīng)答減弱,對胚胎父系抗原呈現(xiàn)免疫低反應(yīng)性，很難產(chǎn)生更多的抗體，致使母體封閉抗體缺乏，母體對胚胎的免疫耐受被打破,排斥反應(yīng)增強，妊娠早期就可能出現(xiàn)流產(chǎn),晚期則可能會出現(xiàn)妊娠高血壓、胎兒宮內(nèi)生長遲緩等，甚至最終胎死宮內(nèi)。

基于以上原理，目前國內(nèi)外致力于研究采用丈夫或無關(guān)個體淋巴細(xì)胞對母體進(jìn)行免疫治療，誘導(dǎo)母體產(chǎn)生針對丈夫個別基因的抗體，即封閉抗體，通過這種免疫功能的改變及封閉抗體的介導(dǎo)，增強母體對胚胎的免疫保護(hù)，提高妊娠成功率。因此，本研究特選擇100例封閉抗體陰性不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)病例，其中60例進(jìn)行淋巴細(xì)胞免疫治療，并于治療后復(fù)查封閉抗體、T細(xì)胞亞群和IgG、IgM含量的改變，另40例采用常規(guī)方法保胎治療，對比兩組妊娠結(jié)局，探討封閉抗體與妊娠結(jié)局之間的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，試驗組經(jīng)免疫治療后妊娠成功率為81.7%，與國內(nèi)的文獻(xiàn)報道相似( 70.0%～87.9%)[7]，而對照組經(jīng)常規(guī)保胎治療妊娠成功率只有37.5%，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。試驗組60例患者中，經(jīng)免疫治療后，封閉抗體轉(zhuǎn)陽數(shù)為51人，其中再次流產(chǎn)者5人，妊娠成功率90.3%，封閉抗體仍為陰性者9人，再次流產(chǎn)6人，妊娠成功率33.3%，經(jīng)統(tǒng)計，封閉抗體陽性組與陰性組妊娠成功率有統(tǒng)計學(xué)差異，可見封閉抗體陽性可大大提高妊娠成功率，有利于妊娠的繼續(xù)維持。免疫治療后雖然并非所有患者封閉抗體都轉(zhuǎn)為陽性，但封閉抗體陽性組妊娠成功率遠(yuǎn)高于陰性組，封閉抗體的產(chǎn)生從一定程度上可預(yù)示妊娠結(jié)局，它可提示母體免疫耐受形成,易于胎兒存活。而妊娠失敗的病例,可能是由于多種因素相互影響所致，其原因需要進(jìn)一步探討。本研究中我們對免疫治療后妊娠成功的新生兒進(jìn)行了出生時體重、生長發(fā)育、智力水平等方面的隨訪，均未發(fā)現(xiàn)異常，說明該種免疫治療方法是安全可靠的。

為進(jìn)一步了解患者免疫治療前后免疫狀態(tài)的改變，本研究特對治療組免疫治療前后T細(xì)胞亞群及IgG、IgM進(jìn)行了檢測，患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群有了明顯變化。結(jié)果顯示，患者CD4+T細(xì)胞較治療前下降，CD8+T細(xì)胞治療后明顯上升，CD4+/CD8+下降，IgG與IgM治療后亦明顯下降，各項指標(biāo)免疫治療前后均有顯著性差異。一般認(rèn)為, CD4+T和CD8+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)對維持機體的免疫平衡至關(guān)重要，CD4+T細(xì)胞比率增加可強化母體細(xì)胞免疫功能,增強對胚胎的免疫排斥，對妊娠不利，而CD8+T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中起著負(fù)調(diào)節(jié)作用，它既可抑制體液免疫, 又可抑制由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)及增殖反應(yīng)等, 從而有利于妊娠繼續(xù)維持[8]?；颊咴谥委熀驣gG、IgM明顯下降,這說明通過免疫治療可改善機體的免疫狀態(tài), 患者的免疫調(diào)節(jié)趨于正常，提高了妊娠成功率。

在免驗治療實施過程中，我們密切觀察患者注射局部反應(yīng)，結(jié)果提示注射部位局部皮膚反應(yīng)的輕重可預(yù)示免疫治療效果，隨著免疫治療次數(shù)的增加，患者皮膚反應(yīng)逐漸減輕，注射皮膚局部有紅腫硬結(jié)甚或水泡者，妊娠結(jié)局預(yù)后良好，若局部皮膚反應(yīng)不明顯，一般妊娠預(yù)后不理想。

綜上，對缺乏封閉抗體的習(xí)慣性流產(chǎn)母體進(jìn)行免疫治療，療效肯定，方法簡便，無不良反應(yīng)，亦可減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，值得在臨床加強推廣。

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