藏茵陳總萜酮致突變性及抗突變性研究*

王 沖，侯 娟，韓 晶，芮 菁

(天津市藥品檢驗所，天津300070)

藏茵陳總萜酮致突變性及抗突變性研究*

王 沖，侯 娟，韓 晶，芮 菁

(天津市藥品檢驗所，天津300070)

目的:研究藏茵陳總萜酮在不同劑量下的致突變及抗突變作用。方法:Ames實驗采用預培養(yǎng)法，微核實驗采用連續(xù)灌胃給藥10 d的小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核計數(shù)法。結果:致突變實驗中，藏茵陳總萜酮在＜2 500 μg/皿和＜40 mg/kg劑量下，未誘發(fā)Ames實驗各菌株回變菌落數(shù)和微核實驗骨髓嗜多染紅細胞微核率的增高?？雇蛔儗嶒炛校匾痍惪傒仆?25～2 500 μg/皿濃度范圍內(nèi)，可使陽性劑環(huán)磷酰胺和絲裂霉素C所誘發(fā)的高回變菌落數(shù)出現(xiàn)明顯降低;藏茵陳總萜酮在50～100 mg/kg劑量范圍，可使陽性劑40 mg/kg環(huán)磷酰胺或2 mg/kg絲裂霉素C所誘發(fā)的高微核率出現(xiàn)明顯降低。結論:本實驗條件下，藏茵陳總萜酮不存在基因突變和染色體畸變作用，且有顯著的抗突變作用。

藏茵陳總萜酮，致突變，抗突變

藏茵陳又名“蒂達”，系中華民族藥中瑰寶，青藏高原藏藥八珍之一，用于治療熱癥、肝膽病與血液病，療效顯著，藥用價值高［1］;另一方面，其植株生長周期短，有效成分含量高，來源豐富，具有可觀的經(jīng)濟價值［2］。近年來，伴隨著民族醫(yī)藥的迅猛發(fā)展，國內(nèi)外已開發(fā)出很多以藏茵陳為主要原料的治療藥物和保健用品，用于某些疾病的防治和保健［3］?，F(xiàn)代分析表明，藏茵陳中主要活性成分為環(huán)烯醚萜、呫噸酮、三萜等化學成分［4］。本研究對藏茵陳總萜酮進行了Ames實驗及小鼠骨髓微核實驗，以了解受試物是否具有體內(nèi)、體外的致突變性和抗突變性，為藏茵陳的安全應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物藏茵陳總萜酮(TTKS)，黃色粉末狀，為龍膽科獐牙菜屬川西獐牙菜Swertia mussotii Franch提取物，天津藥物研究院田成旺研究員惠贈，經(jīng)高效液相色譜法檢測其中獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龍膽苦苷、芒果苷和當歸醇苷的總質(zhì)量分數(shù)為87.5%［5］。受試物以二甲基亞砜溶解為200 mg/ml，實驗時以生理鹽水稀釋至相應濃度。

1.1.2 實驗動物SPF級KM小鼠，軍科院衛(wèi)生環(huán)境醫(yī)學研究所實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(軍)2009－0003，實驗動物使用許可證號SYXK(津)2011－0007。小鼠維持飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，許可證號SCXK(京)2009－0012。動物飼養(yǎng)室溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。人工照明，12 h明/12 h暗。實驗動物于環(huán)境中適應3 d后用于實驗。

1.1.3 菌株與試劑組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100和TA102菌株及大鼠肝微粒酶(S9)，購自上海寶錄生物科技有限公司，MOLTOX公司產(chǎn)品，菌株經(jīng)特性鑒定合格后使用;S9mix用Cofactor－I，購自オリエンタル酵母工業(yè)株式會社。陽性對照物9－氨基吖啶(9－AA)、呋喃基糠酰胺(AF－2)、2－氨基芴(2－AAn)、環(huán)磷酰胺(CP)及絲裂霉素C(MMC)，Sigma公司產(chǎn)品。氯化鈉、氯化鉀、瓊脂等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 致突變實驗

1.2.1.1 Ames實驗［6］采用平板摻入法，用TA100菌株的非代謝活化系統(tǒng)進行預實驗，分別設受試物5 000、2 500、1 250、625、312、156、78和39 μg/皿8個劑量組，每個劑量2個平行皿，37℃下培養(yǎng)48 h后，鏡下觀察平皿中細菌背景菌苔的多少或有無。結果在劑量2 500 μg/皿時，未出現(xiàn)明顯的抑菌現(xiàn)象，故正式實驗最高劑量采用2500 μg/皿。正式實驗:選取TA97、TA98、TA100和TA102菌株，采用平板摻入法。受試物設5個劑量組，分別為2 500、1 250、625、312和156 μg/皿;同時設空白對照組，給予生理鹽水;溶劑對照組給予二甲基亞砜;陽性對照組分別給予9－AA，AF－2，MMC及2－AAn。每個測試濃度設3個平行皿，在活化(+ S9)與非活化(－S9)條件下，37℃培養(yǎng)48 h進行實驗。計數(shù)每皿的回變菌落數(shù)，計算各組平均值和標準差及各劑量組平均回變菌落數(shù)與自發(fā)回變菌落數(shù)的比值(mutation ratio，MR)。若MR＞2，且呈劑量－反應關系者為陽性結果。重復實驗1次。

1.2.1.2 微核實驗選取KM小鼠50只，雌雄各半，體重為22～24 g，隨機分為5組，每組10只。設受試物100、50和25 mg/kg 3個劑量組，及環(huán)磷酰胺陽性對照組和溶劑對照組。小鼠按20 ml/kg灌胃，溶劑對照及各受試物組連續(xù)灌胃10 d，溶劑對照組給予等劑量生理鹽水，末次給予受試物后6 h，小鼠脫臼處死;陽性對照組一次性腹腔給予環(huán)磷酰胺40 mg/kg，24 h后處死動物。取股骨骨髓常規(guī)制片，甲醇固定，Giemsa染色。鏡檢嗜多染紅細胞(PCE)，每只動物計數(shù)1 000個，計算含微核的細胞數(shù)(MN)及微核細胞千分率，同時計數(shù)200個嗜多染紅細胞，計算嗜多染紅細胞與正紅細胞的比值(PCE/NCE)。

微核率(‰)=(含有微核的細胞數(shù)/嗜多染紅細胞數(shù))×1 000‰。

1.2.2 抗突變實驗［7］

1.2.2.1 Ames實驗選用TA100和TA102兩個菌株。將菌株、±S9混合液和陽性劑(CP或MMC)三者均勻混合后，于37℃振蕩水浴培養(yǎng)箱中，預培養(yǎng)30 min后，再加入不同濃度的受試物及頂層培養(yǎng)基，混合均勻后倒碟，其他實驗方法同致突變實驗。

1.2.2.2 微核實驗選取KM小鼠90只，雌雄各半，體重為22～24 g，隨機均分為9組，其中受試物高、中、低劑量各2組(給予不同陽性藥)，溶劑對照組及陽性對照組。溶劑對照及受試物各劑量組連續(xù)灌胃給予10 d，溶劑對照組給予等劑量的生理鹽水。于動物處死前24 h，除溶劑對照組外，各組均一次性腹腔注射給予致突變劑40 mg/kg CP或2 mg/kg MMC，末次給予受試物6 h后處死小鼠。常規(guī)取股骨骨髓，小牛血清稀釋后涂片，干燥，甲醇固定，Giemsa染色，每只小鼠于油鏡下計數(shù)1 000個PCE中出現(xiàn)的MN。

1.2.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，骨髓微核率采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 致突變實驗

2.1.1 Ames實驗藏茵陳總萜酮各劑量組對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100及TA102誘發(fā)的回變菌落數(shù)見表1。在加與不加S9的條件下，各菌株陽性對照組MR均大于2;而藏茵陳總萜酮各組的MR均小于2，與自發(fā)回變數(shù)相比，未見明顯增加，表明藏茵陳對鼠傷寒沙門氏菌無致突變作用。

2.1.2 微核實驗藏茵陳總萜酮各劑量組對小鼠骨髓細胞微核率的影響見表2。結果顯示:陽性對照組微核細胞率為30.4‰，與溶劑對照組比較，具有極顯著性差異(P＜0.01)。藏茵陳總萜酮各劑量組微核細胞率均小于3‰，與溶劑對照組比較，差異無顯著性(P＞0.05)。

2.2 抗突變實驗

2.2.1 Ames實驗藏茵陳總萜酮各劑量組對鼠傷寒沙門氏菌TA100及TA102誘發(fā)的回變菌落數(shù)見表3。兩種菌株于不同的致突變劑［烷化劑－環(huán)磷酰胺(需代謝活化)，絲裂霉素(不需代謝活化)］作用下，可致菌株回變菌落數(shù)顯著增加，MR均大于2。藏茵陳總萜酮于625～2 500 μg/皿范圍內(nèi)，可降低兩種菌株回變菌落數(shù)，與相應的陽性對照組比較，均有顯著性差異。表明藏茵陳總萜酮對陽性誘變劑所誘導的Ames試驗菌株的回復突變具有拮抗作用。重復實驗一次(數(shù)據(jù)未顯示)，兩次實驗結果一致。

2.2.2 微核實驗陽性組和各劑量加陽性試劑處理組所誘發(fā)的微核細胞率見表4。結果顯示:MMC、CP組的微核細胞率均有顯著升高，分別為33.5‰及28.9‰。動物連續(xù)灌胃給予受試物3個劑量10 d，微核細胞率有明顯降低，并且伴隨著藏茵陳總萜酮劑量的增加而減少。藏茵陳總萜酮50、100 mg/kg劑量組與陽性對照組比較，有顯著性差異。

表1 藏茵陳總萜酮Ames實驗結果(s)

表1 藏茵陳總萜酮Ames實驗結果(s)

?

表2 藏茵陳總萜酮微核實驗結果(s)

表2 藏茵陳總萜酮微核實驗結果(s)

與陰性對照組比較，＊＊P＜0.01

?

表3 藏茵陳總萜酮的Ames實驗抗突變結果(

表3 藏茵陳總萜酮的Ames實驗抗突變結果(

與陽性對照組相比，*P＜0.05;＊＊P＜0.01陽性藥物:TA100:CP 200 μg/皿;TA102:MMC 2 μg/皿

?

表4 藏茵陳總萜酮的微核試驗抗突變結果(s)

表4 藏茵陳總萜酮的微核試驗抗突變結果(s)

與陽性對照組相比，*P＜0.05;＊＊P＜0.01

?

3 討論

藏茵陳總萜酮為川西獐牙菜提取物，由環(huán)烯醚萜類、呫噸酮類、三萜類等多種成分構成，具有廣泛的生物活性。環(huán)烯醚萜類主要包括獐牙菜苦苷、獐芽菜苷、龍膽苦苷等，具有抗炎、抗膽堿、修復肝損傷細胞、保護胃潰瘍、抗癌等藥理活性［8，9］;呫噸酮類包括芒果苷、當藥醇苷、1－三羥基－3，3，4－三甲氧基呫噸酮等，具有抑制轉(zhuǎn)氨酶升高、抗乙肝病毒等廣泛的藥理活性［10］。相對于藏茵陳功效學的研究，其毒理方面的研究卻鮮有報道［11］。通過本實驗表明，藏茵陳主要活性成分——總萜酮在＜2 500 μg/皿和＜40 mg/kg劑量下，Ames實驗和微核實驗結果均為陰性，根據(jù)WHO的標準判定，可認定該受試物為非遺傳毒物。

為進一步檢測藏茵陳總萜酮是否具有抗突變的特性，本實驗參考已有的文獻方法［7，12］，根據(jù)藥物抗突變的一般機理，設計了不同目的的抗突變性實驗。其中，Ames實驗設計以考查受試物是否具有促進已突變細胞的DNA修復，減少DNA損傷數(shù)量為目的;小鼠微核實驗設計以考查受試物是否具有保護未突變細胞免受損傷或減少細胞DNA損傷數(shù)量為目的。結果表明，藏茵陳既有促進已突變細胞DNA修復的細胞內(nèi)抗突變作用，又可保護未突變細胞免受損傷，對致突變物有一定的滅活作用。

綜上所述，在本實驗條件下，藏茵陳總萜酮未引起Ames實驗菌株回復突變數(shù)及小鼠骨髓微核率增加，提示藏茵陳總萜酮無致突變性。另一方面，藏茵陳總萜酮可拮抗由CP及MMC引起的突變作用，提示藏茵陳總萜酮具有抗突變性。

1唐麗，馬瑛，蔡晨秋，等.大孔吸附樹脂法富集純化藏茵陳總黃酮［J］.中醫(yī)藥學報，2011，39(1):51

2劉瑩，田成旺，張鐵軍.藏茵陳的藥理與臨床研究進展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2012，25(5):345

3汪海英.八味獐牙菜散加減治療慢性膽囊炎80例［J］.浙江中醫(yī)雜志，2009，44(7):537

4馬麗娜，張鐵軍，田成旺，等.大孔樹脂分離純化川西獐牙菜中環(huán)烯醚萜苷類和口山酮類成分的工藝研究［J］.中草藥，2010，41(2):227

5李爽，田成旺，吳帥，等.藏茵陳總萜酮的人腸內(nèi)細菌代謝研究［J］.中國中藥雜志，2012，37(24):3743

6劉臻，梅松，劉冬英，等.馬尾松松針粉袋泡茶水提物的急性毒性和致突變性研究［J］.癌變·畸變·突變，2012，24(5):383

7林飛，郭芳，李銘，等.北豆根多糖的致突變性與抗突變性研究［J］.實用腫瘤學雜志，2007，21(3):208

8喬偉，張彥文，吳壽金，等.天然環(huán)烯醚萜類化合物的生物活性［J］.國外醫(yī)藥·植物藥分冊，2001，16(2):65

9周源，劉英姿，李鋒，等.獐芽菜苦苷對乙醇致小鼠胃潰瘍的保護作用［J］.中國新藥雜志，2008，17(20):1768

10Li J C，F(xiàn)eng L，Sun B H，et al.Hepatoprotective activity of the constituents in Swertia pseudochinensis［J］.Biol Pharm Bull，2005，28: 534

11黃仁勇.口服藏茵陳片出現(xiàn)男子性功能障礙1例［J］.藥物流行病學雜志，2000，9(1):45

12王明臣，張善鋒，毛麗紅，等.Ames實驗對葉黃素的致突變性及抗突變性研究［J］.癌變·畸變·突變，2006，18(1):65

Studies on the safety and anti－mutagenicity of total terpene ketones form Swertia mussotii

Wang Chong，Hou Juan，Han Jing，Rui Jing
(Tianjin Institute for Drug Control，Tianjin 300070)

Objective:To study the mutagenic and anti－mutagenic activity of total terpene ketones from Swertia mussotii (TTKS)under different doses.Methods:The studies were conducted with Ames test of preceding incubate and micronucleus test in mouse which was administrated gavage once a day for a consecutive 10 d.Results:In mutagenic test，TTKS at a dose lower than 2000 μg/plate induced neither remarkable nor dose－dependent increase mutagenicity of the four strains and at a dose lower than 100 mg/kg did not increase the micronucleus frequencies of polychromatic erythrocytes.In anti－mutagenic test，comparing with the positive groups of CP and MMC，TTKS at 625～2500 μg/plate could decrease the colony numbers in T100and T102strains; TTKS at 50～100 mg/kg could significantly reduced the rate of micronucleus frequencies polychromatic erythrocytes in bone marrow of mice induced by CP and MMC as compared with the positive control.Conclusion:Under our experimental conditions，TTKS has no effect of mutagenesis and processes significant anti－mutagenic properties.

total terpene ketones from Swertia mussotii，mutagenicity，anti－mutagenicity

R965

A

1006-5687(2014)01-0017-04

2013-10-09