2 種青稞多糖對(duì)胰α-淀粉酶的抑制作用

李志鵬，周晨熠，潘書童，崔澤文，謝 凡，王光強(qiáng)，艾連中，張 匯

（上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093）

淀粉在體內(nèi)的消化速率與人體健康息息相關(guān)。研究表明，淀粉的快速消化會(huì)引起餐后血糖的升高，從而誘發(fā)代謝性疾病的發(fā)生，如II型糖尿病和心血管疾病，而通過(guò)飲食管理調(diào)控淀粉消化速率可有效降低代謝性疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[1]。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是人體中重要的消化酶，直接參與淀粉的消化[2]。淀粉在進(jìn)入人體消化道后，通過(guò)α-淀粉酶水解成低聚糖，這些低聚糖在α-葡萄糖苷酶的作用下轉(zhuǎn)化成葡萄糖，并經(jīng)小腸吸收進(jìn)入血液，導(dǎo)致餐后血糖升高[3]。因此，抑制胰α-淀粉酶活性可能是延緩淀粉消化，調(diào)控淀粉類食物餐后血糖水平的有效途徑，從而預(yù)防和緩解II型糖尿病等代謝性疾病[4]。

研究表明，膳食多糖與人體健康息息相關(guān)，增加膳食多糖的攝入可以降低肥胖、心血管疾病、II型糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。谷物中含有豐富的膳食多糖，如阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖。青稞是大麥的變種，主要種植在高海拔和寒冷地帶[7]。青稞中含有豐富的膳食多糖，其中青稞阿拉伯木聚糖（highland barley arabinoxylan，HBAX）和青稞β-葡聚糖（highland barleyβ-glucan，HBBG）分別是來(lái)源于青稞麩皮和胚乳中的主要膳食多糖[8]。研究表明，HBAX由6 個(gè)阿拉伯木聚糖重復(fù)單元通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接而成，其阿拉伯糖和木糖的物質(zhì)的量比為0.58，與其他谷物麩皮中的阿拉伯木聚糖結(jié)構(gòu)類似[9-10]。HBBG則是以三糖和四糖組成的線性β-葡聚糖，其三糖和四糖比例為1∶1，與燕麥（三糖和四糖比例為1.5∶2.3）等谷物的β-葡聚糖差異顯著[11-12]。有研究表明，谷物多糖會(huì)與淀粉相互作用，改變淀粉凝膠的糊化和流變特性，從而減慢淀粉在體內(nèi)的消化速率[13]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HBAX和HBBG對(duì)淀粉的糊化和流變特性有不同的影響，HBAX可以附著在淀粉顆粒表面，降低淀粉體系黏度，HBBG則與淀粉分子發(fā)生交聯(lián)，增加了淀粉體系黏度，這表明不同青稞多糖調(diào)控淀粉消化的作用機(jī)制可能不同[14]。此外，一些研究還表明谷物多糖還可通過(guò)抑制α-淀粉酶活性延緩淀粉的消化[15]。然而，谷物多糖通過(guò)抑制胰α-淀粉酶調(diào)控淀粉消化速率的作用機(jī)制尚不明確，解析不同谷物多糖延緩淀粉消化和降低淀粉類主食餐后血糖響應(yīng)的作用機(jī)制對(duì)預(yù)防和控制相關(guān)代謝疾病的發(fā)生和發(fā)展將發(fā)揮重要作用。

本研究以2 種青稞多糖HBAX和HBBG為原料，通過(guò)酶活性抑制實(shí)驗(yàn)比較兩者對(duì)胰α-淀粉酶活性的影響，通過(guò)酶促動(dòng)力學(xué)分析2 種多糖對(duì)胰α-淀粉酶抑制方式和類型的差異，采用熒光光譜分析2 種多糖對(duì)胰α-淀粉酶的相互作用關(guān)系，以期闡明HBAX和HBBG抑制胰α-淀粉酶活性的異同。本研究將為不同青稞多糖在淀粉消化調(diào)控和低血糖生成指數(shù)食物中的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞仁和青稞麩皮均來(lái)自青海省；豬胰α-淀粉酶和可溶性淀粉（來(lái)源于馬鈴薯）上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、氫氧化鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

725型紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；RF6000熒光分光光度計(jì) 日本島津公司；C-MAG MS10磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司；DK-8AD型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 2 種青稞多糖的制備

參考Zhang Hui等[11]的方法，從青稞仁中提取β-葡聚糖。青稞仁粉分散于70%乙醇溶液，攪拌12 h（料液比1∶10（g/mL）），去除油脂、低聚糖等成分。脫脂后的青稞仁粉按料液比1∶10（g/mL）加入去離子水和高溫α-淀粉酶（4 000 U/g），在95 ℃反應(yīng)30 min，冷卻至室溫后，加入NaOH溶液使體系中NaOH濃度為0.5 mol/L，室溫下攪拌3 h，離心，上清液用鹽酸（2 mol/L）調(diào)節(jié)pH 5.0，靜置過(guò)夜后4 500 r/min離心，上清液透析，濃縮，冷凍干燥得到HBBG，得率為4.3%。通過(guò)AOAC 991.43的方法，測(cè)得β-葡聚糖含量為85.50%[11]。

根據(jù)徐中香等[16]的方法，從青稞麩皮中提取阿拉伯木聚糖。青稞麩皮粉采用95%乙醇溶液脫脂，脫脂的青稞麩皮粉按料液比1∶10（g/mL）加入去離子水和高溫α-淀粉酶（4 000 U/g），95 ℃反應(yīng)30 min，冷卻至室溫后，離心，料渣干燥。脫脂、脫淀粉后的青稞麩皮粉按料液比1∶25（g/mL）加入0.375 mol/L的NaOH溶液，55 ℃攪拌萃取3 h，離心，上清液用鹽酸（2 mol/L）調(diào)節(jié)pH 4.5，靜置過(guò)夜后4 500 r/min離心，上清液透析，濃縮，冷凍干燥得到HBAX，得率為3.7%。根據(jù)苗露等[17]的方法，通過(guò)高效陰離子交換色譜測(cè)得阿拉伯木聚糖含量為75.57%。

1.3.2 2 種青稞多糖對(duì)胰α-淀粉酶的抑制作用測(cè)定

參考張永均等[18]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。將可溶性淀粉（來(lái)源于馬鈴薯，10 mg/mL）溶于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.02 mol/L，pH 6.8）溶液中，置于95 ℃條件下糊化20 min，冷卻至室溫后使用。將HBAX或HBBG溶解在相同濃度PBS中配制成不同濃度的多糖溶液。胰α-淀粉酶（1 mg/mL）溶解在相同濃度PBS中并在5 000 r/min離心10 min，取上清液于4 ℃保存。

移取適量的胰α-淀粉酶溶液與多糖溶液或PBS（空白）混合，使HBAX或HBBG終質(zhì)量濃度為0～7 mg/mL或者0～15 mg/mL，胰α-淀粉酶終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。將混合溶液于37 ℃孵育10 min后加入糊化后的淀粉溶液0.5 mL（10 mg/mL），混勻后繼續(xù)孵育5 min。反應(yīng)結(jié)束后加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液，混勻，沸水浴5 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，再加入10 mL去離子水稀釋，混合均勻后測(cè)定混合溶液在540 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

背景組是以滅活酶溶液與多糖溶液或者PBS（空白）混合，其余步驟一致。IC50值為抑制50%酶活力所需的抑制劑質(zhì)量濃度，通過(guò)對(duì)抑制率曲線多變量非線性回歸計(jì)算獲得。不同青稞多糖對(duì)胰α-淀粉酶的抑制率通過(guò)式（1）計(jì)算：

式中：A1為樣品組與樣品背景組吸光度的差值；A2為對(duì)照組（以同等體積PBS代替多糖溶液）與對(duì)照背景組吸光度的差值。

1.3.3 2 種青稞多糖對(duì)胰α-淀粉酶的抑制方式分析

應(yīng)注重學(xué)科最新成果和技術(shù)的運(yùn)用 在介紹國(guó)內(nèi)外最新理論或國(guó)家政策的同時(shí)，還應(yīng)增加最新的技術(shù)成果的應(yīng)用，加強(qiáng)教材的時(shí)代性和科學(xué)性。

按照1.3.2節(jié)方法，在1 mL反應(yīng)體系中，移取不同質(zhì)量濃度的HBAX（0～1.6 mg/mL）或HBBG（0～8 mg/mL）溶液0.25 mL，加入不同質(zhì)量濃度酶（0.1～0.4 mg/mL）溶液0.25 mL，37 ℃孵育10 min后加入糊化后的可溶性淀粉（16 mg/mL）溶液0.5 mL，繼續(xù)孵育2 min，反應(yīng)結(jié)束后加入1 mL DNS試劑，混勻，沸水浴5 min，冷卻至室溫，加入10 mL去離子水稀釋，混合均勻后測(cè)定混合溶液在540 nm波長(zhǎng)處的吸光度。通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系吸光度的變化，作出酶促反應(yīng)速率（ΔA/min）與胰α-淀粉酶質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線圖。根據(jù)曲線圖特點(diǎn)判斷HBAX和HBBG對(duì)胰α-淀粉酶的抑制方式（可逆或不可逆）。

1.3.4 2 種青稞多糖對(duì)胰α-淀粉酶的抑制類型分析

按照1.3.2節(jié)方法，在1 mL反應(yīng)體系中，移取不同質(zhì)量濃度的HBAX（0～1.6 mg/mL）或HBBG（0～8 mg/mL）溶液0.25 mL，加入0.4 mg/mL酶溶液0.25 mL，37 ℃孵育10 min后加入不同質(zhì)量濃度糊化后的可溶性淀粉溶液0.5 mL（1～9 mg/mL），繼續(xù)孵育2 min，反應(yīng)結(jié)束后加入1 mL DNS試劑，混勻，沸水浴5 min，冷卻至室溫，加10 mL去離子水稀釋，混勻后測(cè)定混合溶液在540 nm處的吸光度。以可溶性淀粉溶液濃度的倒數(shù)1/S為橫坐標(biāo)，酶促反應(yīng)速率（ΔA/min）的倒數(shù)1/V為縱坐標(biāo)，作出Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖，根據(jù)曲線特點(diǎn)判斷HBAX和HBBG對(duì)胰α-淀粉酶的抑制類型。

競(jìng)爭(zhēng)性抑制：

非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：

以直線的斜率和縱坐標(biāo)截距分別對(duì)HBAX和HBBG質(zhì)量濃度進(jìn)行二次作圖，可求得抑制劑對(duì)酶的抑制常數(shù)KI和酶-底物復(fù)合物的抑制常數(shù)KIS，計(jì)算如式（4）、（5）所示：

式中：V為初始反應(yīng)速率/（ΔA/min）；S為底物質(zhì)量濃度/（m g/m L）；Vmax為最大初始反應(yīng)速度/（ΔA/min）；I為抑制劑質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Km為米氏常數(shù)/（mg/mL）；KI和KIS分別為抑制劑與酶和酶-底物復(fù)合物結(jié)合的平衡常數(shù)/（mg/mL）。

1.3.5 2 種青稞多糖對(duì)胰α-淀粉酶熒光猝滅分析

1.3.6 2 種青稞多糖對(duì)胰α-淀粉酶熒光猝滅機(jī)制分析

熒光猝滅可分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，猝滅類型的判斷可由KSV或Ka值區(qū)分。為了驗(yàn)證青稞多糖與胰α-淀粉酶之間的猝滅機(jī)理，采用Stern-Volmer方程分析猝滅數(shù)據(jù)，見式（6）：

式中：F0為不存在猝滅劑時(shí)相對(duì)穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度；F為存在猝滅劑時(shí)熒光強(qiáng)度；[Q]為猝滅劑質(zhì)量濃度/（mg/mL）；τ0為沒(méi)有猝滅劑存在情況下熒光分子的平均壽命，約為10－8s；Ka為雙分子猝滅速率常數(shù)/（mL/（mg·s））；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)/（mL/mg）。

2 種青稞多糖的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)由式（7）確定：

式中：K為表觀結(jié)合常數(shù)/（mL/mg）；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)一式三份，并使用Microsoft Excel計(jì)算各參數(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，由Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種青稞多糖對(duì)胰α-淀粉酶的抑制作用分析

淀粉需要通過(guò)α-淀粉酶的初步水解，才能被α-葡萄糖苷酶水解為可供人體吸收的葡萄糖。因此，抑制胰α-淀粉酶活性可有效地降低淀粉的消化速率。據(jù)報(bào)道，一些天然多糖能抑制胰α-淀粉酶活性[20]。為研究不同青稞多糖對(duì)胰α-淀粉酶的抑制作用，在相同質(zhì)量濃度的胰α-淀粉酶溶液中加入不同濃質(zhì)量度多糖溶液，分析HBAX和HBBG對(duì)胰α-淀粉酶活性的影響，結(jié)果如圖1所示。隨著HBAX和HBBG質(zhì)量濃度的升高，兩者對(duì)胰α-淀粉酶的抑制率均增大，這表明HBAX和HBBG均能抑制胰α-淀粉酶活性。但兩者對(duì)胰α-淀粉酶抑制速率變化存在顯著差異：隨著HBAX質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)胰α-淀粉酶的抑制作用逐漸增大，最后達(dá)到最大抑制率74%左右；而HBBG在低質(zhì)量濃度范圍（0～7 mg/mL）時(shí)，對(duì)胰α-淀粉酶的抑制率變化不大，從17%上升至27%，在高質(zhì)量濃度范圍（7～15 mg/mL），對(duì)胰α-淀粉酶的抑制率從27%快速上升至56%。HBAX和HBBG對(duì)胰α-淀粉酶的IC50值分別為3.26 mg/mL和13.23 mg/mL，這表明在相同質(zhì)量濃度下，HBAX對(duì)胰α-淀粉酶的抑制效果顯著優(yōu)于HBBG。綜上所述，HBAX和HBBG對(duì)胰α-淀粉酶都具有抑制作用，但是HBAX的抑制活性強(qiáng)于HBBG。

2.2 不同青稞多糖對(duì)胰α-淀粉酶的抑制方式判斷

HBAX和HBBG對(duì)胰α-淀粉酶活性的抑制能力不同，這可能與其抑制機(jī)制不同有關(guān)。由圖2可知，在相同多糖質(zhì)量濃度下，酶初始反應(yīng)速率隨胰α-淀粉酶質(zhì)量濃度的增加而增加。此外，不同質(zhì)量濃度HBAX和HBBG酶初始反應(yīng)速率與酶質(zhì)量濃度的線性關(guān)系曲線都通過(guò)原點(diǎn)，表明HBAX和HBBG對(duì)胰α-淀粉酶的抑制均為可逆抑制[21]?？赡嫘砸种普f(shuō)明HBAX和HBBG均是通過(guò)非共價(jià)鍵（疏水相互作用、氫鍵等）與胰α-淀粉酶相互作用，導(dǎo)致酶活力降低[22]。結(jié)果表明，HBAX與HBBG對(duì)胰α-淀粉酶的抑制方式相同，但是這2 種多糖對(duì)胰α-淀粉酶的抑制類型還需要進(jìn)一步研究。

圖2 不同質(zhì)量濃度HBAX（A）和HBBG（B）對(duì)胰α-淀粉酶反應(yīng)速率的影響Fig.2 Effects of HBAX (A) and HBBG (B) at various concentrations on the reaction rate of pancreatic α-amylase

2.3 2 種青稞多糖對(duì)胰α-淀粉酶的抑制類型判斷

HBAX和HBBG對(duì)胰α-淀粉酶的抑制均為可逆抑制，而可逆抑制又分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制和混合型抑制[23]。通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖可判斷2 種多糖對(duì)胰α-淀粉酶的抑制類型[24]。其中，擬合曲線在X軸上的截距代表－1/Km值，Y軸截距代表1/Vmax值。由圖3A所示，隨著HBAX質(zhì)量濃度增加，Km值由1.89 mg/mL增大至2.04 mg/mL，Vmax值由0.17 ΔA/min減小至0.04 ΔA/min，這表明HBAX對(duì)胰α-淀粉酶的抑制為競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性的混合型抑制。由圖3B可知，隨著HBBG質(zhì)量濃度增加，Km值由5.26 mg/mL減小至3.57 mg/mL，Vmax值由0.28 ΔA/min減小至0.16 ΔA/min，這表明HBBG對(duì)胰α-淀粉酶的抑制為反競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性的混合型抑制。競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性混合抑制說(shuō)明HBAX既能與淀粉競(jìng)爭(zhēng)同一活性位點(diǎn)結(jié)合在酶的活性部位，阻礙酶和底物的結(jié)合，使酶促反應(yīng)速率下降，又能通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制與酶的非活性部位結(jié)合，形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物，從而阻斷酶促反應(yīng)的進(jìn)行[25]。反競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性混合抑制說(shuō)明HBBG不僅能夠與酶的非活性部位結(jié)合，還能與酶-淀粉復(fù)合物結(jié)合，形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物。

表1 HBAX和HBBG對(duì)胰α-淀粉酶的抑制常數(shù)Table 1 Inhibitory constants of HBAX and HBBG on the activity of pancreatic α-amylase

圖3 不同質(zhì)量濃度HBAX（A）、HBBG（B）抑制胰α-淀粉酶的Lineweaver-Burk及HBAX（C）、HBBG（D）質(zhì)量濃度與斜率的關(guān)系Fig.3 Lineweaver-Burk plots for inhibition of pancreatic α-amylase by HBAX (A) and HBBG (B) at different concentrations,and plots of the slope versus the concentration of HBAX (C) and HBBG (D)

HBAX和HBBG對(duì)胰α-淀粉酶的抑制類型不同，其在胰α-淀粉酶上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)也可能不同。通過(guò)斜率與HBAX（R2=0.994 1）或HBBG（R2=0.907 9）質(zhì)量濃度作線性相關(guān)圖，如圖3C、D所示，表明HBAX和HBBG在胰α-淀粉酶上有一個(gè)或者一種結(jié)合位點(diǎn)[26]。綜上所述，HBAX和HBBG在胰α-淀粉酶上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)相同，但2 種多糖對(duì)胰α-淀粉酶的抑制類型不同，這可能導(dǎo)致2 種多糖對(duì)胰α-淀粉酶產(chǎn)生不同的抑制效果。

2.4 2 種青稞多糖對(duì)胰α-淀粉酶的抑制常數(shù)計(jì)算

KI和KIS分別是抑制劑與酶或者酶-底物復(fù)合物結(jié)合的平衡常數(shù)，其值可以反映抑制劑和酶或酶-底物復(fù)合物親和力的大小，親和力越大，代表抑制劑與酶或酶-底物復(fù)合物結(jié)合越緊密，其抑制效果越好[27]。HBAX和HBBG的KI和KIS值如表1所示，HBAX的KI和KIS值均小于HBBG，說(shuō)明HBAX對(duì)胰α-淀粉酶的抑制能力遠(yuǎn)大于HBBG，這與IC50值結(jié)果一致。HBAX的KI值小于KIS值，而HBBG的KI遠(yuǎn)大于KIS值，這說(shuō)明HBAX和HBBG與酶或者酶-底物復(fù)合物的親和力不同，HBAX對(duì)酶的親和力強(qiáng)于酶-底物，而HBBG對(duì)酶-底物復(fù)合物親和力更強(qiáng)[28]。綜上所述，雖然HBAX和HBBG都是混合型抑制，但是HBAX和HBBG對(duì)酶或酶-底物復(fù)合物親和力不同，這可能是其對(duì)胰α-淀粉酶抑制效果不同的原因之一。

2.5 2 種青稞多糖對(duì)胰α-淀粉酶熒光光譜分析

酶抑制動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明，HBAX和HBBG對(duì)胰α-淀粉酶的抑制類型不同，HBAX更傾向于與酶直接結(jié)合，而HBBG更容易形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物。但是，這2 種多糖與酶的相互作用機(jī)制仍不明確。通過(guò)熒光光譜不僅能監(jiān)測(cè)多糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合，還能得出多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合機(jī)制、結(jié)合常數(shù)以及猝滅常數(shù)等信息[29]。胰α-淀粉酶的內(nèi)源熒光性主要來(lái)源于色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，其中色氨酸和酪氨酸的激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，最大熒光強(qiáng)度在340 nm左右[29]。此外，最大熒光強(qiáng)度的波長(zhǎng)能反映這些芳香族氨基酸所處微環(huán)境的變化[30]。如圖4所示，隨著多糖質(zhì)量濃度增大，胰α-淀粉酶在340 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低，這說(shuō)明HBAX或HBBG與胰α-淀粉酶皆存在相互作用[31]。胰α-淀粉酶發(fā)生熒光猝滅表明青稞多糖可能與胰α-淀粉酶的色氨酸和酪氨酸發(fā)生靜電相互作用或氫鍵作用，從而使酶的空間構(gòu)象發(fā)生一定改變，導(dǎo)致酶活性下降。圖4還表明在相同質(zhì)量濃度水平下，HBAX對(duì)胰α-淀粉酶的熒光猝滅作用強(qiáng)于HBBG，說(shuō)明HBAX與胰α-淀粉酶的相互作用強(qiáng)于HBBG，這與酶抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，隨著HBAX質(zhì)量濃度增加，胰α-淀粉酶的最大熒光強(qiáng)度波長(zhǎng)發(fā)生紅移現(xiàn)象，說(shuō)明HBAX對(duì)胰α-淀粉酶的相互作用改變了胰α-淀粉酶中色氨酸和酪氨酸的微環(huán)境，胰α-淀粉酶的色氨酸和酪氨酸殘基的疏水結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，極性增加，疏水性降低[32]。HBBG最大熒光強(qiáng)度的波長(zhǎng)并未發(fā)生紅移或者藍(lán)移現(xiàn)象，說(shuō)明HBBG不改變胰α-淀粉酶中色氨酸和酪氨酸的微環(huán)境。因此，HBAX和HBBG都能與胰α-淀粉酶相互作用，但是HBAX對(duì)胰α-淀粉酶內(nèi)部微環(huán)境影響更大。

圖4 不同質(zhì)量濃度HBAX（A）和HBBG（B）對(duì)胰α-淀粉酶的熒光猝滅光譜Fig.4 Fluorescence quenching spectra of pancreatic α-amylase by HBAX (A) and HBBG (B) at various concentrations

2.6 2 種青稞多糖對(duì)胰α-淀粉酶結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合常數(shù)計(jì)算

熒光猝滅過(guò)程可分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[33]。對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅來(lái)說(shuō)，隨著溫度的升高，反應(yīng)體系的擴(kuò)散系數(shù)增加，分子運(yùn)動(dòng)加快，猝滅常數(shù)KSV增大；反之，靜態(tài)猝滅隨著溫度升高，相互作用產(chǎn)物遭到破壞，猝滅常數(shù)KSV減小[34]。通過(guò)Stern-Volmer方程，分析了3 個(gè)溫度下（298、304、310 K）HBAX和HBBG對(duì)胰α-淀粉酶的熒光猝滅規(guī)律，結(jié)果如圖5所示，熒光猝滅分析的KSV和Ka值的計(jì)算結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，當(dāng)溫度從298 K上升至310 K時(shí)，HBAX的KSV值從1.50 mL/mg降低至0.92 mL/mg，HBBG的KSV值從0.20 mL/mg降低至0.16 mL/mg，這表明HBAX和HBBG與胰α-淀粉酶的猝滅類型皆為靜態(tài)猝滅[35]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，靜態(tài)猝滅說(shuō)明酶抑制劑與胰α-淀粉酶形成了非熒光復(fù)合物，從而引起熒光強(qiáng)度的降低[36]。此外，KSV值反映了多糖的擴(kuò)散和與酶的碰撞對(duì)酶熒光壽命衰減速率的影響，HBAX的KSV值遠(yuǎn)大于HBBG，這說(shuō)明HBAX對(duì)胰α-淀粉酶內(nèi)源熒光的影響更大。

表2 HBAX和HBBG在不同溫度下對(duì)胰α-淀粉酶的猝滅參數(shù)Table 2 Quenching parameters of HBAX and HBBG against pancreatic α-amylase at different temperatures

圖5 HBAX（A）、HBBG（B）不同溫度下對(duì)α-淀粉酶的Stern-Volmer曲線以及HBAX（C）、HBBG（D）對(duì)胰α-淀粉酶猝滅作用的對(duì)數(shù)曲線Fig.5 Stern-Volmer plots for the quenching of pancreatic α-amylase by HBAX (A) and HBBG (B) at different temperatures,and plots of lg[(F0-F)/F]versus lg[Q]for quenching effects of HBAX (C) and HBBG (D) on pancreatic α-amylase

HBAX和HBBG與胰α-淀粉酶的結(jié)合常數(shù)（K）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）計(jì)算結(jié)果如表2所示。HBAX和HBBG在不同溫度（298、304、310 K）下結(jié)合位點(diǎn)n均近似于1，推測(cè)HBAX和HBBG與胰α-淀粉酶有一個(gè)或一種類型的結(jié)合位點(diǎn)，這與前面Lineweaver-Burk圖結(jié)果一致。同時(shí)，K值能反映抑制劑與酶的親和力，K值越大，抑制劑與酶的親和力越高。HBAX的K值遠(yuǎn)大于HBBG，說(shuō)明HBAX對(duì)酶活性抑制強(qiáng)于HBBG，這與前面IC50值結(jié)果一致。綜上所述，HBAX和HBBG在胰α-淀粉酶皆有一個(gè)或一種類型的結(jié)合位點(diǎn)，但是HBAX對(duì)胰α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)影響更大，這可能是其抑制作用更強(qiáng)的原因之一。

3 結(jié)論

通過(guò)酶促動(dòng)力學(xué)和熒光猝滅分析比較了HBAX和HBBG對(duì)胰α-淀粉酶的抑制作用，證明了HBAX和HBBG通過(guò)與胰α-淀粉酶相互作用抑制酶促反應(yīng)，但HBAX的抑制能力顯著優(yōu)于HBBG。酶促動(dòng)力學(xué)分析表明HBAX不僅能與酶活性位點(diǎn)結(jié)合，還能形成酶-淀粉-抑制劑復(fù)合物阻礙酶反應(yīng)，而HBBG只能和酶的非活性位點(diǎn)結(jié)合形成酶-淀粉-抑制劑復(fù)合物，這可能是HBAX抑制作用強(qiáng)于HBBG的原因之一。此外，HBAX和HBBG均能通過(guò)靜態(tài)猝滅胰α-淀粉酶的內(nèi)源熒光，但HBAX還能使胰α-淀粉酶內(nèi)部疏水環(huán)境極性增加，這可能是HBAX抑制作用強(qiáng)于HBBG的另一重要原因。該研究表明，不同青稞多糖延緩淀粉消化和降低淀粉類主食餐后血糖響應(yīng)的作用機(jī)制不同，后續(xù)將通過(guò)熱力學(xué)理論進(jìn)一步研究不同青稞多糖與α-淀粉酶相互作用的分子機(jī)理。