廣玉蘭花總黃酮提取及其抗氧化活性研究

郝玉民　李立祥　易昶寺等

摘要 [目的]篩選廣玉蘭花中總黃酮的提取方法，并研究其抗氧化活性。[方法]采用乙醇回流提取法對(duì)廣玉蘭花中總黃酮進(jìn)行提取，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察乙醇濃度、提取溫度、料液比和提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取效果的影響，通過超氧陰離子自由基（O2-·）和羥自由基（·OH） 的清除試驗(yàn)，對(duì)廣玉蘭花總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行研究，并與維生素C和抗氧化劑特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）進(jìn)行比較。[結(jié)果]利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝條件為：乙醇濃度70%，料液比1∶40（g/ml），提取時(shí)間90 min，提取溫度70 ℃；在該提取條件下，總黃酮平均含量為4.896%，總黃酮平均純度為32.925%。廣玉蘭花總黃酮對(duì)自由基的清除率隨總黃酮濃度的增大而上升，總黃酮清除O2-·及·OH的IC50值分別為0.381 0和0.640 6 mg/ml。廣玉蘭花總黃酮清除自由基的能力高于VC，低于抗氧化劑TBHQ；但當(dāng)總黃酮濃度達(dá)到0.709 2 mg/ml時(shí)，其抗氧化效果接近于TBHQ。[結(jié)論]廣玉蘭花總黃酮具有明顯體外抗氧化作用，是一種極具開發(fā)價(jià)值的天然抗氧化物質(zhì)。

關(guān)鍵詞 廣玉蘭花（Magnolia grandiflora Linn） ； 總黃酮；提?。?抗氧化

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）05-01365-03

Abstract [Objective] To select extraction method for total flavones from Magnolia grandiflora Linn and study its antioxidant activity. [Method] Total flavones were extracted from Magnolia grandiflora by using ethanol reflux extraction method， and the effects of ethanol concentration， extraction temperature， solid-liquid ratio and extraction time on the extraction efficiency of total flavones were separately investigated by using single-factor test and orthogonal experiment. Antioxidant activities of total flavones from Magnolia grandiflora Linn were studied by superoxide anion radical and hydroxyl radicals scavenging tests， and compared with vitamin C and antioxidants TBHQ. [Result] The optimum extraction conditions were as follows： ethanol： 70%， solid-liquid ratio： 1∶40， extraction time： 90 min， extraction temperature：70 ℃. The

average content of total flavones was 4.896%， and the purity of total flavones averaged 32.925%. The results show that， the clearance rate of total flavones from Magnolia grandiflora Linn on free radical raised with the increasing of the concentration of total flavones. The IC50 values of scavenging superoxide anion radicals and hydroxyl radicals of total flavones were 0.381 0 and 0.640 6 mg/ml. The capacity of scavenging free radical of total flavones from Magnolia grandiflora Linn is higher than Vc， but lower than TBHQ. When the concentration of total flavones was 0.709 2 mg / ml， the antioxidant effect close to TBHQ. [Conclusion] The total flavones from Magnolia grandiflora Linn as a natural antioxidant substance of great exploitation value have significant in vitro antioxidant effect.

Key words Magnolia grandiflora Linn； Total flavones； Extraction； Antioxidant activity

廣玉蘭（Magnolia grandiflora Linn） 系木蘭科木蘭屬（Magnolia）喬木樹種。其花蕾的醇提物具有明顯擴(kuò)張血管和降壓作用，并對(duì)血小板聚集及血栓形成起抑制作用，可能與其所含黃酮成分有關(guān)[1]。與廣玉蘭同科屬的白玉蘭、望春玉蘭和武當(dāng)玉蘭的花蕾是中藥辛夷，為名貴中藥，已被人們熟知。其性辛溫，無毒，有驅(qū)風(fēng)散寒通竅理肺的功效，主要用于治療風(fēng)寒頭痛、鼻塞、鼻淵、鼻流和濁涕等[2]。辛夷主要有效成分有黃酮、生物堿、木脂素和揮發(fā)油等[3]。辛夷的乙醇提取物具明顯的抑菌、擴(kuò)張血管、降血壓及對(duì)血小板聚集和血栓形成起抑制作用等藥理活性[4]。何開躍等用廣玉蘭葉片制備乙酸乙酯提取物，利用顯色反應(yīng)初步鑒定其成分，再以人工抗氧化劑PG（沒食子酸丙酯）和天然抗氧化劑PA（植酸）為對(duì)照，測(cè)定了其體外抗氧化活性，并用2種體系DPPH·（1，1-二苯基苦基苯肼自由基）和卵磷脂進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，廣玉蘭葉片乙酸乙酯提取物有較好的抗氧化作用[5]。樊正球等應(yīng)用微波輔助頂空固相微萃取法（MAE-HS-SPME） 法從廣玉蘭葉片中提取出48種揮發(fā)性化合物[6-7]。

黃酮類化合物在植物界分布很廣泛，目前發(fā)現(xiàn)的已達(dá)5 000余種，可劃分為10大類。其中，黃酮醇類、黃酮類、花青素類、兒茶素類、黃烷醇類和異黃烷醇類等6大類黃酮在飲食中存在更為廣泛[8]。黃酮類化合物的藥理作用和機(jī)制被廣泛研究，發(fā)現(xiàn)除了明顯抗氧化作用外，還有明顯改善血脂紊亂、抗炎、抗血小板聚集、抗血栓和保護(hù)心腦血管疾病等作用[9]。近年來，大量研究表明黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，同時(shí)具有抑菌、抗心肌梗塞等藥理保健功能且毒副作用很小，是一類極具開發(fā)價(jià)值的天然有機(jī)抗氧化劑[10]。Sandra R等用化學(xué)熒光法對(duì)5種不同黃酮類化合物對(duì)抗自由基損傷的能力進(jìn)行了分析測(cè)定，確定具有強(qiáng)抗氧化性[11]。Rebai Ben Ammar等研究證明，從Rhamnus alaternus L.葉子中分離得到的3種黃酮類化合物對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基有較強(qiáng)的清除作用[12]。

目前，對(duì)于廣玉蘭花總黃酮的研究?jī)H限于總黃酮的提取，而廣玉蘭花總黃酮的體外抗氧化活性的研究在國內(nèi)鮮有報(bào)道。廣玉蘭資源豐富，廣玉蘭花中含有較豐富的黃酮類化合物，卻未能被開發(fā)利用，造成很大的資源浪費(fèi)。為了進(jìn)一步開發(fā)和利用廣玉蘭，筆者對(duì)廣玉蘭花中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并用O2-·和·OH 自由基清除法研究其抗氧化活性，旨在開發(fā)廣玉蘭花中天然活性物質(zhì)資源，并為廣玉蘭花資源綜合開發(fā)與利用，特別是為具備藥用價(jià)值產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對(duì)象。鮮廣玉蘭花，采于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，置于微波爐中殺青處理120 s后，于烘箱中70 ℃烘干，粉碎。

1.1.2

主要儀器。ml204 電子分析天平，購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Vis 7200 紫外可見分光光度計(jì)，購自尤尼柯（上海）儀器有限公司； DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，購自上海-恒科技有限公司；TG16-W 微量高速離心機(jī)，購自湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SHZ-DIII 循環(huán)水真空泵，購自鄭州英峪予華儀器有限公司；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，購自國華電器有限公司；SENCOR 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自上海申生科技有限公司；AJF-2001-P超純水機(jī)，購自重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司；NN-S672SF 微波爐，購自上海松下電器有限公司；JFSD-100 粉碎機(jī)，購自上海嘉定糧油儀器有限公司。

1.1.3

主要試劑。蘆丁對(duì)照品，購自成都曼斯特生物科技有限公司；NaNO2、NaOH、Al（NO3）3、VC、無水乙醇、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、鹽酸、過氧化氫和鄰苯三酚等，均為分析純；TBHQ（特丁基對(duì)苯二酚）為食品添加劑；三羥甲基氨基甲烷（tris）為國產(chǎn)生化試劑，市售。

1.2 方法

1.2.1

廣玉蘭花總黃酮的測(cè)定方法。

1.2.1.1

線性關(guān)系的考察[13]。精密稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20 mg，加濃度80%乙醇溶解，定容至100 ml容量瓶中，搖勻，制成0.2 mg/ml對(duì)照品溶液。分別取該溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 ml于10 ml容量瓶中，加0.4 ml濃度5%NaNO2溶液，搖勻放置6 min；然后加入0.4 ml濃度10%Al（NO3）3溶液，搖勻放置6 min；再加4 ml濃度4%NaOH溶液，加水至刻度，搖勻，放置15 min，于510 nm波長(zhǎng)測(cè)定各吸光度，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.1.2

提取液中總黃酮含量的測(cè)定。取1.0 ml廣玉蘭花總黃酮提取液于10 ml容量瓶中，其余步驟按與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法操作，參照空白，測(cè)定提取液的吸光度，并利用線性回歸方程計(jì)算總黃酮的含量。

1.2.2

總黃酮的提取工藝設(shè)計(jì)。

1.2.2.1

單因素試驗(yàn)。（1）乙醇濃度對(duì)廣玉蘭花中總黃酮含量的影響。取廣玉蘭花干燥粉末適量，按料液比1∶40（g/ml，W/V，下同）分別加入濃度分別為40%、50%、60%、70%和80%的乙醇溶液，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間120 min，測(cè)定廣玉蘭花中總黃酮的含量。（2）料液比對(duì)廣玉蘭花中總黃酮含量的影響。取廣玉蘭花干燥粉末適量，分別按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50加入濃度為70%的乙醇溶液，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間120 min，測(cè)定廣玉蘭花中總黃酮的含量。（3）提取時(shí)間對(duì)廣玉蘭花中總黃酮含量的影響。取廣玉蘭花干燥粉末適量，按料液比1∶40加入濃度70%的乙醇溶液，提取溫度70 ℃，分別提取30、60、90、120和150 min，測(cè)定廣玉蘭花中總黃酮的含量。（4）提取溫度對(duì)廣玉蘭花中總黃酮含量的影響。取廣玉蘭花干燥粉末適量，按料液比1∶40加入濃度70%的乙醇溶液，提取溫度分別為40、50、60、70和80 ℃，提取時(shí)間為120 min，測(cè)定廣玉蘭花中總黃酮的含量。

1.2.2.2

正交優(yōu)化試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）對(duì)影響總黃酮提取效果的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)一步研究各因素對(duì)提取效果的影響，篩選出提取最佳工藝參數(shù)。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

3 結(jié)論與討論

廣玉蘭花總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度為70%，料液比為1∶40，提取時(shí)間90 min，提取溫度70 ℃；在該提取條件下，總黃酮平均含量為4.896 0%，總黃酮純度平均為32.925%。由于提取液中醇溶性雜質(zhì)種類較多，導(dǎo)致總黃酮純度相對(duì)較低。如果在規(guī)?；a(chǎn)中對(duì)產(chǎn)品的純度要求較高時(shí)，可進(jìn)一步進(jìn)行分離純化處理。

廣玉蘭花總黃酮清除O2-·和·OH自由基的IC50值分別為0.381 0和0.640 6 mg/ml，其清除能力均高于VC，低于抗氧化劑TBHQ；但當(dāng)總黃酮濃度達(dá)到0.709 2 mg/ml時(shí)，其抗氧化效果均接近于TBHQ，表明廣玉蘭花總黃酮對(duì)O2-·及·OH有良好的清除作用，用廣玉蘭花總黃酮替代TBHQ作為抗氧化劑使用，能夠避免TBHQ自身的毒性，因此可作為一種天然抗氧化劑進(jìn)行開發(fā)利用。

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