10%粉紅粘帚菌可濕性粉劑的研制

邵龍　吳紅渠　李晶等

摘要 [目的]為獲得符合國家化學(xué)農(nóng)藥標準的粉紅粘帚菌分生孢子可濕性粉劑。[方法]選擇常用助劑和粉紅粘帚菌分生孢子進行生物相容性檢測，初步篩選出影響較小或者沒有影響的助劑，篩選出的助劑，進行粉紅粘帚菌可濕性粉劑的研制。[結(jié)果]最終確定10%可濕性粉劑的配方為：粉紅粘帚菌的分生孢子粉10%，潤濕分散劑EFW 1%、K12 2%、D425 7%、NNO 7%，紫外保護劑黃原膠0.3%，載體凹凸棒土補足100%。[結(jié)論]檢測結(jié)果表明粉紅粘帚菌分生孢子可濕性粉劑的潤濕時間為18s，質(zhì)量懸浮率75.87%，孢子懸浮率72.05%，pH 5.9，含水量1.92%，98.34% 可通過200目篩，符合國家化學(xué)農(nóng)藥可濕性粉劑的標準，為粉紅粘帚菌可濕性粉劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 粉紅粘帚菌；可濕性粉劑；研制

中圖分類號 S718.85 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）05-01353-03

Abstract [Objective] The aim was to develop the qualified Clonostachys rosea WP which is in accordance with National Pesticide Standard. [Method] The pesticide adjuncts were screened according to biocompatibility. The wettable powder of Clonostachys rosea was developed with these screened adjuncts which have no or less effects on the bioactivities of Clonostachys rosea. [Result] The compositions of 10% Clonostachys rosea WP： Clonostachys rosea powder 10%； wettable and dispersible agents： EFW 1%， K12 2%， D425 7%， NNO 7%； UV protectant： Xanthan gum 0.3%； Palygouskite as filler make up to 100%. [Conclusion] The test results showed that the wettability was 18 second， weight suspensibility was 75.87%， spore suspensibility was 72.05%， pH value was 5.9， the moisture was 1.92% and the fineness was 98.34% through 200 μm sieve. Every index of wettable powder of Clonostachys rosea was in accordance with National Pesticide WP standard. This study may provide theoretical basis for the development of Clonostachys rosea wettable powder.

Key words Clonostachys rosea； Wettable powder； Preparation

粉紅粘帚菌（Clonostachys rosea），隸屬絲孢菌，是一類廣泛存在于土壤中植物病原真菌的重寄生菌，大量研究表明，可以寄生多種植物病原真菌的菌絲和菌核，如核盤菌屬（Sclerotinia）、腐霉菌（Pythium.spp）、立枯絲核菌（Rhizoctonia.solani）和齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）等，還具有促進植物生長的作用[1-3]。粘帚菌作為菌寄生菌，其作用具有多機制特點，主要有產(chǎn)生抗菌素及毒素、重寄生作用、產(chǎn)生細胞壁降解酶以及協(xié)同作用等[4]。粘帚菌寄生病原菌的過程與哈茨木霉類似[5]，是粘帚菌生防作用的主要機理之一。目前，尚缺乏完善的方法對其作用方式進行全面的研究，深入研究粘帚霉的生防作用機制，有利于更好地控制植物真菌病害的的發(fā)生和充分發(fā)揮其生防潛質(zhì)。粉紅粘帚菌在國外應(yīng)用較為廣泛，在秘魯，木霉菌和粉紅粘帚菌混配成功防治可可莢腐病[6]，混合的生物控制劑不但實現(xiàn)更廣泛的宿主范圍，而且還提高了對環(huán)境的適應(yīng)能力；Kapongo等以粉紅粘帚菌分生孢子粉為載體稀釋白僵菌孢子粉通過蜜蜂混合接種于溫室套籠的番茄和甜椒上，可以控制溫室白粉虱和牧草盲蝽，并成功抑制溫室番茄和甜椒上的灰霉病，其中在番茄花和葉子上灰霉病的抑菌率分別為57%和46%，白粉虱死亡率達49%；在甜椒作物花和葉子上灰霉病的抑菌率分別為59%和47%，牧草盲蝽死亡率達73%[7]，在國內(nèi)粉紅粘帚菌代謝產(chǎn)物用于大豆根結(jié)線蟲[8]，粉紅粘帚霉作為一種生防制劑存在巨大的市場開發(fā)潛力。

鑒于粉紅粘帚菌的產(chǎn)孢能力很強，且其孢子適于長期的保存和培養(yǎng)，對人類不造成危害，對生態(tài)系統(tǒng)無不良影響，同時兼顧粉紅粘帚菌分生孢子的性質(zhì)，可將其加工成固體制劑。由于分生孢子具有疏水性，影響其潤濕性、分散性和懸浮性等物理性能，且作為活體農(nóng)藥，與各種助劑的相容性一般比化學(xué)農(nóng)藥差，某些助劑可能完全不能使用[9]。筆者以粉紅粘帚菌分生孢子為原藥，篩選出適合的載體、潤濕劑、分散劑、紫外保護劑等助劑，加工成合格的可濕性粉劑，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1

供試菌株。粉紅粘帚菌（Clonostachys rosea），于國家林業(yè)局森林病蟲害重點實驗室（東北林業(yè)大學(xué)）保存。

1.1.2

助劑。供試載體：白炭黑、凹凸棒土、硅藻土、高嶺土。供試潤濕分散劑：Morwet EFW、k12、MF5、TERWET1010、WLNO、木質(zhì)素磺酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈣、TERSPERSE 2020、Morwet D425、NNO。供試紫外保護劑：糊精、黃原膠、熒光素鈉、VC 、納米氧化鋅。培養(yǎng)基：PDA；營養(yǎng)液：PD，以上助劑市售。

1.2 試驗方法

1.2.1

助劑生物相容性的測定。采用平板計數(shù)法及菌絲生長生長量法。真菌孢子平板計數(shù)法：將載體以5 mg/ml（潤濕劑60 μg /ml分散劑250 μg/ml）濃度與融化的PDA培養(yǎng)基混合[10]，滅菌后制成平板。取0.1 ml濃度為103個孢子/ml的孢子懸浮液均勻涂布在混合培養(yǎng)基平板上，以改良PDA作為對照，每個處理重復(fù)4個，放置在（25±1）℃黑暗培養(yǎng)，72 h后計算菌落數(shù)。菌絲生長速率測定：混合培養(yǎng)基制作方法同上，用直徑為10 mm的打孔器取生長旺盛、菌齡相同的粉紅粘帚菌菌絲塊，接種在混合培養(yǎng)基的平板中心，對照是PDA平板，每個處理重復(fù)4次，每隔24 h測定一次菌落直徑。

菌落直徑日增長量（mm/d） =菌落直徑（mm）/生長天數(shù)（d）

紫外保護劑：將供試保護劑添加到孢子懸浮液中，（以不加紫外保護劑但經(jīng)紫外燈照射的為對照①，以不加紫外保護劑不經(jīng)紫外燈照射的為對照②），涂布到PDA平板上，每個處理重復(fù)3次，在紫外燈下照射1、2、3 min后，放置于（28±1）℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h計算菌落數(shù)。

1.2.2

助劑對制劑性能的影響。①首先對所測試潤濕劑及分散劑進行初篩，選擇潤濕時間<1 min，懸浮狀況優(yōu)良的分散劑，然后進行生物相容性測定，其中潤濕時間按照GB/T54512001標準執(zhí)行[11]，通過目測觀察分散狀況，分散狀況等級劃分參考文獻[12]：篩選出分散性能較好的分散劑，分別加入10%粉紅粘帚菌孢子粉、5%潤濕劑、10%分散劑和65%載體，加工成可濕性粉劑，測定潤濕時間和懸浮率。②潤濕劑和分散劑最優(yōu)配比的篩選：對所選助劑種類和比例進行正交設(shè)計，確定兩者的最佳使用比例[13]。

1.3 劑型的加工

經(jīng)篩選出的各種助劑分別過400目標準篩，按比例加入到載體中攪拌均勻，然后將干燥過的粉紅粘帚菌高孢粉加入到混合物中，混合均勻后加工成可濕性粉劑[14]。

1.4 產(chǎn)品性能測定

孢子萌發(fā)率測定[15]：將粉紅粘帚菌孢子懸浮液接種到PD營養(yǎng)液中，于（28±1）℃和160 r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)20 h后，顯微鏡檢統(tǒng)計活孢子數(shù)，計算活孢子率。潤濕時間按GB/T54512001測定（≤1 min）。懸浮率按GB/T148252006測定（≥75%）[16]。pH按GB/T160093測定[17]，細度通過激光粒徑分布儀測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，評估不同處理之間的95%水平顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體的篩選

由表1可知，除硅藻土對粉紅粘帚菌的分生孢子活性有影響外，其他載體與對照無顯著性差異；從菌絲日增長量看，幾種載體對菌絲的生長都有一定的影響，其中硅藻土與對照差異顯著，其余3種載體與對照差異不顯著，因此其余3種可作為粉紅粘帚菌制劑的載體，從經(jīng)濟角度考慮，凹凸棒土作為粉紅粘帚菌的可濕性粉劑的載體。

2.2 紫外保護劑的篩選

由表2可知，紫外照射對粉紅粘帚菌分生孢子萌發(fā)有很大影響。在紫外照射1 min時，黃原膠與VC、納米氧化鋅對孢子保護作用明顯，與對照②存在顯著差異，糊精對孢子的保護作用不明顯；紫外照射2 min后，黃原膠、糊精仍有保護作用，且與對照②存在顯著差異，納米氧化鋅對孢子仍有保護作用，但與對照②差異不顯著；紫外照射3 min后，黃原膠及納米氧化鋅對孢子的保護明顯，且與對照②存在顯著差異，糊精及VC對孢子也有保護作用，但是與對照②差異不顯著，雖然黃原膠與對照①存在顯著差異，但與其他及對照②仍存在顯著差異，說明它能有效地保護孢子免受紫外損害。因此，可以選擇黃原膠或納米氧化鋅作為紫外保護劑，鑒于成本考慮，故選擇黃原膠。經(jīng)進一步使用濃度篩選，最終確定濃度為0.3%。

2.3 潤濕劑及分散劑的篩選

由表3可知，5種濃度60 μg/ml潤濕劑對分生孢子的影響不同。從分生孢子萌發(fā)看，TERWET 1010、K12與對照差異顯著，影響較大，其余幾種潤濕劑差異不顯著；從菌絲日生長量看，只有EFW與對照差異不顯著，其余幾種潤濕劑與對照差異顯著。綜合分生孢子萌發(fā)及菌絲直徑日生長量，初選EFW、K12、WLNO進行潤濕劑的下一步篩選。

初篩分散劑（濃度均為250 μg/ml）的生物相容性見表4。從分生孢子萌發(fā)角度看，木質(zhì)素磺酸鈉和TERSPERSE 2020與對照差異不顯著，其余3個雖與對照差異顯著，影響不大；從菌落直徑日生長量看，TERSPERSE 2020與菌落生長影響較大，D425、木質(zhì)素磺酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈣、NNO與對照差異不顯著，且木質(zhì)素磺酸鈉促進菌絲生長，TERSPERSE 2020較對照差異顯著，雖分生孢子為主要的侵染體，但綜合制劑性能角度，這4種分散劑均可進行分散劑的細選。將上述粗篩的濕潤分散劑以一定比例與孢子粉、載體加工成可濕性粉劑后，進行潤濕時間和懸浮率的考察。不同潤濕劑分散劑配制的可濕性粉劑的濕潤時間和懸浮率見表5。

3 結(jié)論與討論

通過對載體、潤濕分散劑、紫外保護劑的篩選，確定了粉紅粘帚菌可濕性粉劑的最佳配方為粉紅粘帚菌的分生孢子粉10%，潤濕分散劑EFW 1%、K12 2%、D425 7%、NNO 7%，紫外保護劑黃原膠0.3%，載體凹凸棒土補足100%，在此條件下制備的粉紅粘帚菌可濕性粉劑分生孢子含量大于5×108個分生孢子/g。以粉紅粘帚菌可濕性粉劑的潤濕時間、質(zhì)量懸浮率、孢子懸浮率和貯藏后的活孢率作為參考指標，既兼顧了制劑的性能，還參考了載體及助劑對粉紅粘帚菌分生孢子的生物相容性，較全面地考慮到活體微生物劑型加工的要求。而目前粉紅粘帚菌菌株制劑加工研究甚微，為我國粉紅粘帚菌產(chǎn)品的發(fā)展提供了理論和技術(shù)基礎(chǔ)，而其室外大田試驗結(jié)果有待進一步研究。

參考文獻

[1]YLIMATTILA T，KALKO T，HANNUKKALA A，et al.Prevalence，species composition，genetic variation and pathogenicity of clover rot（Sclerotinia trifoliorum） and Fusarium spp in red clower in Finland[J].European Joumal of Pathology ，2010，126（1）：6-29.

[2] MATHRE D E，COOK R J，CALLAN N W，et al. From Discovery to Use：Traversing the World of Commercializing Biocontrol Agents for Plant Disease Control[J]. Plant Disease，1999，83（11）：972-983.

[3] SHAMA B K，SINGH B M. Biological control of white rot of pea caused by Sclerotinia sderotiorum （Lib） de Bary [J]. Journal of Biological Control，1990，4（2）：132-134.

[4] HARMAN G E，HOWELL C R，VITERBO A，et al.Trichoderma species—opportunistic，avirulent plant symbionts[J]. Nature Reviews Microbiology，2004，2：43-56.

[5] 李立平，段德芳.木霉生物學(xué)特性及拮抗作用研究進展[J]. 植物醫(yī)生，2006，19（4）：4-6.

[6] ULRIKE KRAUSS，MARTIJN TEN HOOPEN，ROBERT REES，et al.Mycoparasitism by Clonostachys byssicola and Clonostachys rosea on Trichoderma spp. from cocoa （Theobroma cacao） and implication for the design of mixed biocontrol agents Original Research Article[J].Biological Control，2013，67（3）：317-327.

[7] BALOYI M A，LAING M D，YOBO K S. Use of mixed cultures of biocontrol agents to control sheep nematodes[J].Veterinary Parasitology，2012，184（23）：367-370.

[8] 王麗芳，許艷麗，LI S X，等.粉紅粘帚菌代謝物對南方根結(jié)線蟲卵孵化及二齡幼蟲的影響[J].大豆科學(xué)，2011，30（5）：818-822.

[9] 申繼忠.微生物農(nóng)藥劑型加工研究進展[J].中國生物防治，1998，14（3）：129-133.

[10] 張敏，彭化賢，鄧新平，等.5億活孢子/克木霉菌可濕性粉劑的研制[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，21（3） ：675-679.

[11] 國家標準總局.（GB/T 5451-2001）農(nóng)藥可濕性粉劑潤濕性測定方法[S].北京：中國標準出版社，2001.

[12] 張建榮.撲草凈懸浮劑專用助劑的研究和應(yīng)用[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2003（4）：24-26.

[13] 蓋鈞鎰.試驗統(tǒng)計方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：294-295.

[14] 劉步林.農(nóng)藥劑型加工技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1998.

[15] 方中達.植病研究方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1977：173-175.

[16] 國家標準總局.（GB/T14825-2006）農(nóng)藥懸浮率測定方法[S].北京：中國標準出版社，2006.

[17] 國家標準總局.中華人民共和國國家標準《pH值測定方法》（GB/T1600-93）[S].北京：中國標準出版社，1993.