低溫脅迫下鹿蹄草生理響應(yīng)變化分析

李文馨　孫彩玉　胡海清等

摘要 [目的]探尋低溫脅迫對(duì)鹿蹄草的影響機(jī)制。[方法]以鹿蹄草葉片為材料，測(cè)定不同冷處理?xiàng)l件下葉片各種保護(hù)酶（SOD、POD、CAT）、丙二醛、葉片相對(duì)電導(dǎo)率、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等含量變化情況。[結(jié)果]葉片的SOD酶與POD酶均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，但變化幅度不盡相同；CAT酶則呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，但變化幅度不大。丙二醛的積累與葉片相對(duì)電導(dǎo)率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。脯氨酸、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量隨脅迫時(shí)間增加呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。[結(jié)論]該方法研究了低溫脅迫對(duì)鹿蹄草的影響，為鹿蹄草的合理利用提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞 鹿蹄草（Pyrola.calliantha H.Andres）；低溫脅迫；生理響應(yīng)

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）05-01361-04

Abstract [Objective] To explore the influence mechanism of low temperature stress on Pyrola calliantha. [Method] The content changes of various protective enzymes （SOD， POD， CAT）， malondialdehyde， leaf relative electrical conductivity， proline acid， soluble protein， soluble sugar in different cold treatments were determined. [Result] The results showed that： leaf SOD and POD enzyme activity were first increased and then decreased， but not the same amplitude， CAT activity is decreased first and then increased， but changes slightly. MDA accumulation and the relative conductivity of leaves are on the rise. Proline， soluble protein and soluble sugar contents show a significant correlation with stress time increasing. [Conclusion] Effects of low temperature stress on Pyrola calliantha were studied， which will provide a reference for reasonable utilization of Pyrola calliantha.

Key words Pyrola calliantha H.Andres； Low temperature stress； Physiological response

鹿蹄草（Pyrola.calliantha H.Andres）屬于鹿蹄草科（Pyrolaceae）鹿蹄草屬（Pyrola L. ）多年生小型草本植物，根莖細(xì)長(zhǎng)，葉?；?，花聚成總狀花序。鹿蹄草屬植物全世界約有30余種，主要分布于北半球的溫帶和寒溫帶地區(qū)。我國(guó)是其主要分布區(qū)，并且種類繁多，共有27種3變種，主要集中分布在西南的四川、云南、貴州、西藏等省和東北的黑龍江大、小興安嶺、吉林長(zhǎng)白山地區(qū)等[1]。中醫(yī)學(xué)上早就將其作為一種中草藥使用。結(jié)果表明，鹿蹄草在醫(yī)學(xué)上具有良好的藥效。隨著中醫(yī)學(xué)對(duì)鹿蹄草的深入研究和廣泛應(yīng)用，其作用效果日益為人們所了解和重視，從而引起世界性的關(guān)注目前，主要是對(duì)鹿蹄草的分布狀況、化學(xué)成分、醫(yī)學(xué)功能及應(yīng)用等領(lǐng)域進(jìn)行了研究[2]。

溫度是植物生存和生活的基本環(huán)境條件之一，低溫是限制植物地理分布的主要因子[3]。鹿蹄草主要分布于我國(guó)東北地區(qū)，是寒溫帶針闊混交林的指示植物，抗逆性較強(qiáng)，冬季仍然存活，在寒地區(qū)形成了獨(dú)特的適應(yīng)寒冷的機(jī)制。目前，對(duì)于鹿蹄草抗寒研究鮮有報(bào)道。筆者通過(guò)測(cè)定低溫脅迫后的鹿蹄草中SOD、POD、CAT活性及丙二醛、葉片相對(duì)電導(dǎo)率、脯氨酸、可溶性蛋白和還原糖等含量變化情況，以期為闡明鹿蹄草對(duì)低溫的適應(yīng)性規(guī)律提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對(duì)象。鹿蹄草植株，采自五大連池老黑山地區(qū)。移栽入盆，用營(yíng)養(yǎng)土進(jìn)行培養(yǎng)，后取長(zhǎng)勢(shì)相同植株移入4 ℃人工氣候箱進(jìn)行低溫脅迫處理。

1.1.2

主要試劑。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1

樣品的預(yù)處理。設(shè)置的低溫為4 ℃，連續(xù)梯度時(shí)間低溫脅迫。脅迫時(shí)間分別為0、2、4、6、8和10 d 6個(gè)梯度。分別取長(zhǎng)勢(shì)一致并無(wú)蟲(chóng)害的葉片，用清水洗去表面殘留泥土，再用去離子沖洗2遍。將葉片表面殘留水分吸干，將葉片切成約0.5 cm2小塊，存于錫紙包內(nèi)，每包0.50 g，液氮冷凍，置于-80 ℃保存，以待備用。

1.2.2

試驗(yàn)地點(diǎn)選擇。鹿蹄草材料的低溫處理在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命中心實(shí)驗(yàn)室4 ℃人工氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行；相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定分析在生命中心實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)樓植物生理實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2.3

生理指標(biāo)的測(cè)定方法。超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）法[4]。過(guò)氧化物酶（POD）活性活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[5]。CAT活性的測(cè)定采用紫外吸收法測(cè)定[6]?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量采用考馬氏亮藍(lán)G-250染色法[7]?？扇苄蕴呛坑幂焱壬y(cè)定[8]。脯氨酸含量測(cè)定采用茚三酮比色法[9]。MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[10]。質(zhì)膜相對(duì)透性采用DDS-310型電導(dǎo)儀測(cè)定。

1.2.4

數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，Excel2003進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)鹿蹄草SOD、POD和CAT活性的影響

2.1.1

低溫脅迫處理對(duì)SOD的影響。SOD是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶之一，能夠有效的清除體內(nèi)的自由基[11]。圖1表明，4 ℃低溫脅迫下植物體內(nèi)的SOD活性先增高再降低，當(dāng)?shù)蜏孛{迫時(shí)間達(dá)到6 d時(shí)，SOD酶活性最高，約為初始活性。但隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD酶活性大幅度下降。未經(jīng)脅迫處理的（0 d）與脅迫處理6 d之間的SOD酶活性差異極顯著（P<0.01），與脅迫處理2 d的SOD酶活性差異不顯著（P>0.01），與脅迫處理4、8和10 d的SOD酶活性差異顯著（P<0.05）。

2.1.2

低溫脅迫處理對(duì)POD的影響。POD作為植物保護(hù)酶之一，能夠防御外界不良環(huán)境，其活性與植物的抗寒性呈有一定的關(guān)系[12]。當(dāng)植物體遭受逆境脅迫時(shí)，POD酶可將過(guò)剩的H2O2分解為H2O和O2，從而減輕活性氧對(duì)植物造成的傷害。圖2表明，低溫脅迫使植物體內(nèi)的POD活性呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，并隨著脅迫時(shí)間增加而活性增強(qiáng)。當(dāng)脅迫時(shí)間在2～6 d，POD酶活性呈現(xiàn)大幅度上升趨勢(shì)，并在脅迫6 d時(shí)達(dá)到最大值；但脅迫時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，在6～8 d，POD活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。未經(jīng)脅迫處理的（0 d）與脅迫處理6 d的POD酶活性達(dá)到差異極顯著（P<0.01），與脅迫時(shí)間為2 d時(shí)間差異不顯著（P>0.01），與4、8和10 d的差異顯著（P<0.05）。脅迫時(shí)間為2 d與脅迫4、8和10 d時(shí)間的POD酶活性差異顯著（P<0.05）；與脅迫6 d的POD活性呈現(xiàn)極顯著（P<0.01）。

2.1.3

低溫脅迫處理對(duì)CAT的影響。CAT酶是膜脂過(guò)氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，能夠在逆境脅迫或衰老過(guò)程中減少OH-的形成，保護(hù)膜的結(jié)構(gòu)，減輕毒害，從而使植物忍耐、減緩或抵抗逆境脅迫或延緩器官的衰老 [13]。CAT酶是植物在低溫脅迫下清除體內(nèi)H2O2的關(guān)鍵酶。圖3表明，與SOD酶和POD酶活性相比較，CAT酶出現(xiàn)了低溫脅迫活性先降低后升高的趨勢(shì)，但CAT酶活性隨著脅迫時(shí)間而降低并且低于脅迫處理0 d的CAT酶活性。在脅迫時(shí)間達(dá)到6 d時(shí)，CAT活性出現(xiàn)最低值，并與脅迫處理0 d的CAT酶活性呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05）。

2.2 低溫脅迫處理對(duì)丙二醛（MDA）含量和相對(duì)電導(dǎo)率的影響。

2.2.1

低溫脅迫處理對(duì)MDA含量的影響。MDA是膜脂過(guò)氧化作用的終產(chǎn)物，是膜系統(tǒng)受傷害的重要指標(biāo)[14]，積累的多少，表明組織的保護(hù)能力強(qiáng)弱，細(xì)胞膜遭受破壞是否嚴(yán)重。MDA含量的多少能夠代表質(zhì)膜受傷害的程度[15]。因此，MDA可以作為判斷植株抗冷害能力的指標(biāo)之一[16]。圖4表明，低溫脅迫下，鹿踢草葉片MDA含量出現(xiàn)先上升趨勢(shì)后下降的趨勢(shì)。在脅迫時(shí)間達(dá)到8 d時(shí)，MDA含量達(dá)到最高。當(dāng)脅迫時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至10 d的過(guò)程中，MDA又出現(xiàn)了下降趨勢(shì)。但MDA含量在變化過(guò)程中幅度不如其他生理指標(biāo)變化幅度大。并且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)出不顯著差異。

2.2.2

低溫脅迫處理對(duì)電解質(zhì)滲漏率的影響。電解質(zhì)滲漏率是衡量細(xì)胞組織和細(xì)胞質(zhì)膜的幼嫩程度和是否收到傷害的指標(biāo)[17]。研究表明，植物受到低溫脅迫時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞原生質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞原生質(zhì)透性增大，而透性越大，離子滲漏率越高，說(shuō)明受到的傷害越重，抗寒性也就越弱[18]。圖5表明，隨著低溫時(shí)間的加長(zhǎng)，植物體葉片電解質(zhì)滲漏率隨時(shí)間的增加而變大，當(dāng)脅迫時(shí)間達(dá)到8 d時(shí)，電解質(zhì)滲漏率達(dá)到最高。當(dāng)脅迫時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至10 d的過(guò)程中，電解質(zhì)滲漏率又出現(xiàn)了小幅度下降趨勢(shì)。但在脅迫過(guò)程中，植物體電解質(zhì)滲漏率變化幅度不大，為緩慢增大過(guò)程。并且各個(gè)脅迫時(shí)間點(diǎn)其電解質(zhì)滲漏率呈現(xiàn)不顯著差異。

2.3 低溫脅迫處理對(duì)可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量的影響

2.3.1

低溫脅迫對(duì)可溶性蛋白的影響。蛋白質(zhì)含量的增加，有助于提高細(xì)胞內(nèi)的束縛水含量，降低冰點(diǎn)，從而成為防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰、避免細(xì)胞冰凍死亡的原因之一[19]。研究表明，低溫脅迫下，植物可溶性蛋白質(zhì)含量增加[20-22]。因?yàn)榭扇苄缘鞍椎挠H水性質(zhì)強(qiáng)，能增強(qiáng)細(xì)胞持水力，因而在低溫脅迫下，植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)升高有利于抗冷性的提高。多數(shù)情況可溶性蛋白質(zhì)和總蛋白質(zhì)的含量與抗寒之間存在正相關(guān)。這表明，低溫脅迫能引起植物基因表達(dá)發(fā)生改變，并有新的蛋白質(zhì)合成，參與抗寒性發(fā)育過(guò)程[23-24]。圖6表明，在低溫脅迫的整個(gè)過(guò)程中，植物體內(nèi)可溶性蛋白含量在不斷身高，當(dāng)脅迫是時(shí)間累計(jì)到8 d時(shí)，可容性蛋白含量達(dá)到最高，當(dāng)脅迫時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至10 d時(shí)，可容蛋白含量有所下降，但下降幅度不大。未經(jīng)脅迫與脅迫的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)出差異不顯著（P>0.05），且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均呈現(xiàn)不顯著差異（P>0.05）。在整個(gè)低溫脅迫的過(guò)程中，可溶性蛋白的含量變化幅度較小。

2.3.2

低溫脅迫對(duì)可溶性糖的影響。植物體內(nèi)可溶性糖的含量與植物對(duì)低溫脅迫的抵抗力關(guān)系密切[25]。糖是植物代謝的基礎(chǔ)物質(zhì)，可為脯氨酸的合成提供必需的氧化還原能力，植物體內(nèi)糖含量的變化是低溫脅迫條件下植物代謝敏感較高的生理指標(biāo)之一[26]。大量研究表明，植物在低溫鍛煉過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)可溶性糖含量增加，解除鍛煉時(shí)降低，而且可溶性糖含量的增加是與淀粉水解相平行的[27-31]。圖7表明，可溶性糖含量與可容性蛋白含量保持基本走勢(shì)相同，但可溶性糖含量在脅迫時(shí)間達(dá)到6 d達(dá)到最高值，與未經(jīng)脅迫時(shí)間點(diǎn)可容性糖含量差異顯著（P<0.05）。并在可溶性糖含量達(dá)到最高后保持基本穩(wěn)定的含量。

2.3.3

低溫脅迫對(duì)脯氨酸的影響。游離脯氨酸具有水溶性和水勢(shì)高，在細(xì)胞內(nèi)積累無(wú)毒等特點(diǎn)，因而在植物低溫脅迫過(guò)程中能作防脫水劑而保護(hù)植物[32]。一般情況下逆境中的植物其體內(nèi)的脯氨酸會(huì)大的積累，這是植物對(duì)不良環(huán)境的一種適應(yīng)性反映[33]。脯氨酸的積累是由植物體內(nèi)脯氨酸生物合成激活和脯氨酸降解的抑制共同導(dǎo)致的[34-36]，并非是單因子影響。圖8表明，脯氨酸酸含量在脅迫8 d時(shí)達(dá)到最高值。在0～8 d時(shí)，脯氨酸含量隨著脅迫時(shí)間的增加而增加；當(dāng)脅迫達(dá)到高峰時(shí)，可溶性糖含量有所降低。未經(jīng)脅迫的脯氨酸含量與脅迫8 d的可溶性糖含量呈現(xiàn)出極顯著差異（P<0.01）。0 d與6 d、10 d的脯氨酸含量呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05）。0 d與2 d、2 d與4 d的脯氨酸含量呈現(xiàn)出不顯著差異（P>0.05）。

3 結(jié)論與討論

鹿蹄草主要分布于我國(guó)東北地區(qū)，喜陰，是寒溫帶針闊混交林的指示植物，抗逆性較強(qiáng)。當(dāng)受到低溫脅迫時(shí)，鹿蹄草本身的某些生理指標(biāo)有了明顯變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，SOD酶和POD酶的活性均隨著脅迫時(shí)間的累計(jì)而呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在脅迫6 d時(shí)達(dá)達(dá)到最高，表明保護(hù)酶活性上升可能是鹿蹄草對(duì)低溫脅迫的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，與作用底物活性增加有關(guān)；但隨著溫度的進(jìn)一步降低，植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，活性氧導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，造成膜結(jié)構(gòu)損壞，有害的過(guò)氧化產(chǎn)物MDA逐漸積累，造成SOD、POD等保護(hù)酶系統(tǒng)被破壞，活性下降。但CAT酶活性開(kāi)始便隨著溫度的脅迫時(shí)間增加而活性降低，說(shuō)明CAT酶與植物抗寒性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，因?yàn)樵诘蜏孛{迫積累的過(guò)氧化氫對(duì)CAT酶活性起著重要作用。因此，在試驗(yàn)中，CAT酶并非為植物抗寒性有關(guān)。但植物的受逆境脅迫石油SOD酶、POD酶CAT酶共同協(xié)同作用完成的，才能是自由基維持在某一較低水平老保護(hù)植物蹄本身。

在受低溫脅迫時(shí)，丙二醛含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但上升幅度保持已穩(wěn)定水平。MDA作為膜脂過(guò)氧化最終產(chǎn)物，是反映細(xì)胞膜傷害程度的一個(gè)重要指標(biāo)。試驗(yàn)中，MDA含量出現(xiàn)先升高再降低趨勢(shì)，可能與在低溫脅迫過(guò)程中體內(nèi)通過(guò)增加保護(hù)酶的活性，尤其是SOD酶和POD酶的活性，發(fā)揮保護(hù)作用，抑制低溫引起的O-2的積累，從而降低MDA含量；但隨著溫度進(jìn)一步降低，酶促保護(hù)系統(tǒng)受到破壞，清除自由基的能力。細(xì)胞膜是與外界環(huán)境發(fā)生物質(zhì)交換的主要通道，是細(xì)胞感受環(huán)境脅迫最敏感的部位[37]。質(zhì)膜透性直接影響其離子滲漏率，鹿蹄草在低溫脅迫下的電解質(zhì)滲漏率隨著低溫脅迫時(shí)間的增加而相對(duì)升高，但變化幅度相對(duì)穩(wěn)定，單一以離子滲漏率說(shuō)明作為鹿蹄草抗寒性性參考，說(shuō)明鹿蹄草抗寒性良好?？扇苄蕴?、可溶性蛋白和脯氨酸調(diào)節(jié)滲透勢(shì)來(lái)緩解低溫脅迫成為主要的保護(hù)因素，三者呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中脯氨酸能促進(jìn)蛋白質(zhì)水合作用，溶解可溶性蛋白，使植物具有一定的抗性和保護(hù)作用。在逆境脅迫時(shí)，脯氨酸還能維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞運(yùn)輸和調(diào)節(jié)滲透壓等，并且其積累指數(shù)與植物的抗逆相關(guān)[37]。植物體內(nèi)的可溶性糖會(huì)產(chǎn)生一定的變化，隨著處理溫度的降低，植物體內(nèi)的可溶性糖含量處于增加的趨勢(shì)，低溫鍛煉下，其含量與抗寒性成正相關(guān)[38]。同時(shí)，糖還是冰凍保護(hù)劑，可能對(duì)冰凍敏感的蛋白質(zhì)具有保護(hù)作用[39]。

植物體內(nèi)的抗逆境生理生化變化是一個(gè)復(fù)雜的多因素調(diào)節(jié)的過(guò)程。為了適應(yīng)或抵抗極端低溫等環(huán)境脅迫的影響，鹿蹄草植物從多方面的生理反應(yīng)或低溫適應(yīng)方來(lái)對(duì)外界脅迫進(jìn)行響應(yīng)，從抗寒物質(zhì)代謝到酶系統(tǒng)等方面，都有生理反應(yīng)的共同規(guī)律和各自特有的生理抗寒特性；而且要通過(guò)抗氧化系統(tǒng)等多種途徑不斷清除體內(nèi)由低溫脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基，控制膜脂的過(guò)氧化水平，有效地保護(hù)細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)不受傷害，進(jìn)而保證植物體本身在低溫脅迫環(huán)境下各項(xiàng)生理活動(dòng)的正常進(jìn)行，以及抵抗外界不良環(huán)境脅迫引起的傷害，這些不同變化的共同結(jié)果可能強(qiáng)化了植物的生理功能特性，改善了植物的物質(zhì)代謝，增強(qiáng)了植物的抗寒性和對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)能力。

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