中國人群攜帶m.14484T＞C突變的Leber’s遺傳性視神經(jīng)病變線粒體單體型及多態(tài)位點分析

孟祥娟, 朱金萍, 高敏, 張賽, 趙福新, 張娟娟, 劉曉玲,韋企平, 童繹, 張銘連, 瞿佳, 管敏鑫1,

1. 溫州醫(yī)科大學Attardi線粒體生物醫(yī)學研究院, 浙江省醫(yī)學遺傳學重點實驗室, 溫州 325035;

2. 溫州醫(yī)科大學附屬眼視光學院, 溫州 325027;

3. 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院, 北京 100078;

4. 河北省邢臺市眼科醫(yī)院, 邢臺 054001;

5. 浙江大學遺傳研究所, 杭州 310023

中國人群攜帶m.14484T＞C突變的Leber’s遺傳性視神經(jīng)病變線粒體單體型及多態(tài)位點分析

孟祥娟1,2, 朱金萍1,2, 高敏1,2, 張賽1,2, 趙福新2, 張娟娟5, 劉曉玲2,韋企平3, 童繹2, 張銘連4, 瞿佳2, 管敏鑫1,5

1. 溫州醫(yī)科大學Attardi線粒體生物醫(yī)學研究院, 浙江省醫(yī)學遺傳學重點實驗室, 溫州 325035;

2. 溫州醫(yī)科大學附屬眼視光學院, 溫州 325027;

3. 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院, 北京 100078;

4. 河北省邢臺市眼科醫(yī)院, 邢臺 054001;

5. 浙江大學遺傳研究所, 杭州 310023

線粒體ND6基因(MT-ND6)上的m.14484T＞C突變是Leber’s遺傳性視神經(jīng)病變(Leber’s hereditary optic neuropathy, LHON)的一個原發(fā)性突變, 但該突變自身不足以產(chǎn)生視力損傷。為研究線粒體單體型對攜帶該突變?nèi)巳篖HON發(fā)病的影響, 文章對1 177例中國漢族LHON患者MT-ND6基因進行了全面系統(tǒng)的篩查, 共篩查到67例患者攜帶m.14484T＞C同質(zhì)性突變, 在該研究群體中所占比例為5.7%。攜帶m.14484T＞C突變的51例家系LHON的外顯率從5.6%～100.0%不等, 平均外顯率為21.5%。對家系中51例先證者線粒體全基因組進行分析, 各表現(xiàn)為不同的多態(tài)性, 分別屬于18個東亞線粒體單體型。其中單體型A和單體型F在病例組頻率均明顯低于106例對照組。另外, 單體型M10a在病例組中占9.8%, 在對照組中未被發(fā)現(xiàn), 進一步發(fā)現(xiàn)該單體型家系LHON的平均外顯率(46.13%)顯著高于其他單體型家系的平均外顯率, 提示線粒體單體型M10a可能增加視力損傷的風險。

Leber遺傳性視神經(jīng)病變; 線粒體; 突變; 單體型; 外顯率

Leber遺傳性視神經(jīng)病變(Leber's hereditary optic neuropathy, LHON)是一種主要累及視網(wǎng)膜、鞏膜篩板前部視乳頭黃斑束纖維, 導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞退行性病變的母系遺傳性疾病。1871年, 德國眼科醫(yī)生 Leber首先描述其臨床特征：該病好發(fā)于青壯年男性, 表現(xiàn)為雙眼同時或先后急性或亞急性無痛性視力減退, 可同時伴有中心視野缺失及色覺障礙[1～3]。線粒體DNA(mtDNA)突變是LHON發(fā)病的分子基礎, 自1988年Wallace等[4]發(fā)現(xiàn)LHON家系中MT-ND4基因的m.11778G＞A突變以來, 目前已發(fā)現(xiàn)60多個mtDNA突變與LHON發(fā)病密切相關[5]。絕大多數(shù)LHON患者只攜帶該病3個mtDNA原發(fā)突變(即m.3460G＞A、m.11778G＞A或m.14484T＞C突變)中的一個。本課題組相繼發(fā)現(xiàn)了m.3394T＞C、m.3866T＞C、m.4435A＞G、m.5601C＞T、m.11696G＞A、m.12338T＞C、m.14502T＞C、m.14693A＞G、m.15951A＞G突變與LHON相關[6～15]。在LHON家系中, 發(fā)病或未發(fā)病但攜帶致病性突變的女性, 其后代(即母系成員)均會遺傳相應突變, 但并不是所有母系成員都表現(xiàn)出 LHON癥狀(即不完全外顯), 并且男性突變攜帶者的發(fā)病率高于女性(即性別偏好), 提示其他遺傳因素或環(huán)境因素[16～18]可能對該病產(chǎn)生影響。目前在歐洲白人中已發(fā)現(xiàn)線粒體單體型 J增加攜帶m.11778G＞A、m.14484T＞C突變家系LHON外顯率,單體型K降低攜帶m.3460G＞A突變家系該病的外顯率[19]。Ji等[20]對中國攜帶m.11778G＞A突變的LHON家系研究發(fā)現(xiàn)：線粒體單體型M7b1,2以及單體型G可以增加攜帶 m.11778G＞A突變家系外顯率, 而單體型M8a降低攜帶該原發(fā)突變家系的外顯率。為分析線粒體單體型以及多態(tài)性位點在漢族LHON患者發(fā)病的影響, 本文首先對1 177例患者進行mtDNA突變篩查, 然后從中選取51例攜帶m.14484T＞C突變的LHON先證者進行了臨床評估、家系調(diào)查及線粒體全基因組分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本課題組自 2004年與溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院、北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院眼科、河北省邢臺市眼科醫(yī)院等全國各地多家醫(yī)院合作, 在全國范圍內(nèi)收集了1 177例LHON先證者。同時, 收集106例年齡、種族、地域匹配的健康體檢人群作為正常對照。與所有受試者簽署知情同意書, 并采集受試者外周靜脈血樣3 mL或制成濾紙片。

1.2 方法

1.2.1 眼科臨床檢查

對收集的LHON先證者及部分家系成員進行眼科臨床檢查, 包括標準對數(shù)視力表檢測視力、色覺檢查、視野計檢查視野、電生理儀檢測視覺誘發(fā)電位、眼底照相拍片等檢查。視力損害程度參照世界衛(wèi)生組織標準：正常＞0.3; 0.1≤輕度≤0.3; 0.05≤中度＜0.1; 0.02≤重度≤0.05; 極重度＜0.02。

1.2.2 基因組DNA提取

對患者及對照組取外周靜脈血, 經(jīng)EDTA-K2抗凝或制成濾紙, 用經(jīng)典的酚-氯仿法提取基因組DNA。

1.2.3 PCR擴增及測序分析

對所有患者, 首先對 m.14484T＞C突變所在片段通過正向引物 5′-GCATAATTAAACTTTACTTC-3′和反向引物5′-AGAATATTGAGGCGCCATTG-3′進行引物擴增, 用限制性內(nèi)切酶 MvaⅠ進行酶切鑒定之后進行測序驗證。PCR擴增體系、擴增條件以及檢測方法見參考文獻[3, 21]。

對51例先證者使用24對有部分重疊的正反向引物進行線粒體基因組全序列PCR擴增、純化、正反向引物測序[22]。使用Chromas 2.24、DNASTAR 5.0等軟件對測序結(jié)果與線粒體基因數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://www.mitomap.org)以及修正的mtDNA劍橋參考序列[23]比對分析。同時, 利用同樣的方法對 106例正常對照進行線粒體DNA測序、分析。

1.2.4 種系發(fā)生學分析

為了分析 RNA和氨基酸編碼區(qū)的錯義突變的保守性, 選擇 14個靈長類哺乳動物：白額卷尾猴(Cebus albiforns)、大猩猩(Gorilla gorilla)、人(Homo sapiens)、長臂猴(Hylobates lar)、環(huán)尾狐猴(Lemur catta)、獼猴(Macaca mulatta)、地中海獼猴(macaca sylva)、蜂猴(Nycticebus coucang)、倭黑猩猩(Pan paniscus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、阿拉伯狒狒(Papio hamadryas)、蘇門答臘猩猩(Pongo abelii)、龐戈猴(Pongo pygmaeus)、馬來跗猴(Tarsius bancanus)。查找錯義突變在14個靈長類哺乳動物對應的RNA和氨基酸,計算RNA或氨基酸保守系數(shù), 進行保守性分析。

1.2.5 線粒體單體型分析

通過線粒體全基因組測序結(jié)果的變異位點進行線粒體單體型分析[24,25], 確定線粒體單體型。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計攜帶 m.14484T＞C突變的例數(shù)以及病例組和對照組中各線粒體單體型例數(shù), 計算每種單體型所占比例, 同時通過臨床資料計算各單體型平均外顯率。應用SPSS16.0軟件, 對每種單體型相應的病例組和對照組個數(shù)以及突變位點通過 χ2檢驗, 以 P值＜0.05為具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床評估

對來自全國不同地區(qū)的1 177例病例的mtDNA篩查中, 發(fā)現(xiàn)67例攜帶m.14484T＞C突變, 該突變均為同質(zhì)性突變。對其中51例先證者及其家系成員進行了臨床評估。先證者大多為青年男性(男性 47例, 女性4例), 發(fā)病年齡從6.0歲～44.0歲, 平均年齡為19.0歲。發(fā)病時視力損傷程度從輕度到極重度表現(xiàn)不一。對各先證者家系成員進行分析, 每個家系患者男女比例從3∶0到1∶2, 家系外顯率也不同,從 5.6%～100%不等, 平均外顯率為 21.5%。臨床數(shù)據(jù)具體見表1。

表1 患者臨床資料總結(jié)

2.2 線粒體全基因組變異位點統(tǒng)計

用24對部分重疊引物對51例先證者線粒體全基因組擴增并進行序列測定。結(jié)果與線粒體基因數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://www.mitomap.org)以及修正的mtDNA劍橋參考序列[23]進行比對分析, 發(fā)現(xiàn)379個先前已經(jīng)報道過的突變位點。其中D-Loop區(qū)多態(tài)性位點有105個; RNA編碼區(qū)突變有36個; 氨基酸編碼區(qū)突變有238個, 其中包括同義突變164個, 錯義突變74個。表2詳細列舉了本文篩查到的RNA和氨基酸編碼區(qū)已報道的錯義突變及其相應例數(shù)、氨基酸的改變和14個物種中堿基改變對應的RNA和氨基酸的保守性。

本文對 51例先證者線粒體全基因組進行分析,發(fā)現(xiàn)先前未報到過的突變位點共37個：其中D-Loop區(qū)4個; RNA編碼區(qū)有6個, 其中5個位點具有較高的保守性：m.1829A＞C、m.2406A＞G、m.2607T＞C、m.3180del-A、m.10010T＞G; 編碼氨基酸的同義突變有18個, 錯義突變9個, 其中5個位點具有較高的保守性, 分別是：m.3776G＞A, m.8536A＞G, m.11771C＞G, m.11957A＞G, m.13187C＞G。具體見表3。

表2 本文篩查到的已報道的變異位點

續(xù)表2

2.3 線粒體單體型統(tǒng)計

用51例先證者和106例正常對照的mtDNA序列, 進行線粒體單體型分型。51例先證者屬于18個線粒體單體型, 分別是：B、B4、B5、C、D4、D5、G2、G3、H2、M7、M8、M9、M10a、M11、R11、N9、Y、Z; 106例對照也存在18種線粒體單體型, 分別是：A、D、F、B、B4、B5、C、D4、D5、G2、H2、M7、M8、M9、M11、N9、Y、Z。線粒體單體型的例數(shù)、平均外顯率和平均發(fā)病年齡, 以及對照組和病例組之間的P值等見圖1。

3 討 論

在1 177例先證者中篩查到攜帶m.14484T＞C突變 67例, 該突變頻率在這組漢族 LHON患者中為5.7%。王燕等[1]在110例中國攜帶原發(fā)突變的LHON患者中發(fā)現(xiàn)m.14484T＞C突變頻率為7.3%, 近幾年在歐洲白人患者中發(fā)現(xiàn) m.14484T＞C突變占原發(fā)突變的14%[5]。

表3 本文篩查到的未被報道過的變異位點

圖1 對照組-病例組線粒體單體型分布

線粒體單體型分析需要排除有親緣關系的個體,本研究對所選取的 51例先證者進行線粒體全基因組分析, 發(fā)現(xiàn)RNA編碼區(qū)m.5601C＞T[9]、m.15951A＞G[15]突變和氨基酸編碼區(qū)m.3394T＞C[6]、m.11696G＞A[10]、m.14502T＞C[12]突變被報道與該病相關。此外,還篩查到 37個未被報道過的突變位點, 其中 RNA編碼區(qū)5個位點具有較高的保守性, 除m.2406A＞G的保守性為78.6%, 其余4個位點保守性均為100%;病例組中m.2406A＞G突變有2例, 其余突變均為1例, 對照組中該 5個位點均未發(fā)生突變; 經(jīng)統(tǒng)計學分析, m.2406A＞G突變在病例組和對照組之間P值＜0.05, 具有統(tǒng)計學差異, 但是否為LHON繼發(fā)性突變需要進一步研究。氨基酸編碼區(qū)的 5個較高的保守性位點中, m.3776G＞A保守性為78.6%, m.11957A＞G為88.24%, 其余的保守性為100%; 這5種突變在病例組均為1例, 對照組尚未發(fā)現(xiàn)該5種突變, 經(jīng)分析不具有統(tǒng)計學差異, 尚不能認為這 5種突變與該病相關。

51例先證者大多數(shù)是男性, 發(fā)病年齡不等, 平均為19.0歲, 每種單體型的平均發(fā)病年齡沒有很大差別, 單體型對發(fā)病年齡可能沒有影響?；颊呒蚁低怙@率不等, 平均外顯率為21.5%, 各單體型外顯率差異較大, 提示線粒體單體型影響外顯率的表達。

對具有統(tǒng)計學差異的各線粒體單體型分別進行分析。單體型A、F在正常人群分別有12例、19例,病例組不存在這兩種單體型, 提示線粒體單體型A、F可能降低攜帶m.14484T＞C突變?nèi)巳喊l(fā)病的風險。其中單體型A的特異位點m.4824A＞G突變導致ND2第 119位保守性為 100%的蘇氨酸改變?yōu)楸彼? m.663A＞G突變與12S rRNA第16位相關, 該位的保守性為79%。Kaewsutthi等[26]報道單體型F在攜帶m.11778A＞G 突變的泰國人群中比例很低, 可能降低視力損傷。

線粒體單體型G3在病例組有2例, 對照組不存在該單體型。該東亞線粒體單體型分支特異位點是m.16274G＞A, 對照組有5例突變, 不具有統(tǒng)計學差異。兩例家系平均外顯率為7.0%, 低于平均外顯率,尚不能認為線粒體單體型G3增加攜帶m.14484T＞C突變家系的外顯率。

線粒體單體型 M10a在對照組不存在, 病例組有5例。該單體型平均外顯率為46.1%, 高于總體平均外顯率21.5%。發(fā)病平均年齡為17.4歲。目前國內(nèi)外報道的環(huán)境因素對該病外顯率的影響表現(xiàn)在吸煙飲酒方面, 尚無地理環(huán)境對該病外顯率產(chǎn)生影響的報道。Kirkman等[17]開展了一個較大規(guī)模的基因-環(huán)境因素相互作用的研究, 結(jié)果顯示, 吸煙對LHON發(fā)病的影響不依賴于性別和飲酒習慣而獨立發(fā)生; 只有當過量飲酒時, LHON的發(fā)病才受酗酒的影響[18]。對該單體型的5例患者進行臨床資料分析,其中編號WZ271、WZ272、WZ274、WZ274患者無吸煙飲酒史, 編號WZ273患者具有少量吸煙飲酒史,所以可以排除環(huán)境因素對該種單體型外顯率的影響。進一步對其單體型代表性特異位點進行分析：其中m.14502T＞C突變已被報道是LHON的繼發(fā)性突變[12]; 5例m.15218A＞G突變保守性為78.57%, 導致復合物Ⅰ亞基Cytb第158位蘇氨酸突變?yōu)楸彼?這個位點在對照組未被發(fā)現(xiàn), 有統(tǒng)計學差異。在線粒體單體型M10a中除已知的m.14502T＞C突變之外, m.15218A＞G突變也可能協(xié)同原發(fā)突變對疾病外顯率起到促進作用。

線粒體單體型 R11在對照組沒有, 病例組有 3例。對該單體型特異位點分析, 其中 D-Loop區(qū)m.16311T＞C、m.189A＞G、m.185G＞A突變在對照組也均存在, 無統(tǒng)計學差異, m.13681T＞C為同義性突變, m.10398A＞G、m.12950A＞G、m.11061C＞T、m.10031T＞C突變保守性均較低, 且外顯率 14.4%,低于平均外顯率。尚不能認為單體型 R11對攜帶m.14484T＞C突變家系的外顯率產(chǎn)生影響。

此外線粒體單體型 M9不具有統(tǒng)計學差異, 在病例組有4例, 對照組有3例。家系外顯率為50.9%,明顯高于平均外顯率, 該單體型特異位點m.3394T＞C是LHON的繼發(fā)性突變位點[6], 單體型M9是否增加家系外顯率, 需要進一步研究。

為探究患者線粒體單體型地區(qū)差異, 對臨床資料先證者來源進行分析發(fā)現(xiàn), 除來自河南 3例患者,其中1例屬于單體型M9, 2例屬于單體型M10a, 其他地區(qū)患者所屬線粒體單體型分布趨勢比較均衡。

本文對中國 51例攜帶 m.14484T＞C突變的LHON先證者以及家系進行研究, 初步分析了線粒體單體型對攜帶 m.14484T＞C突變家系外顯率的影響。發(fā)現(xiàn)單體型 A、F可能降低攜帶該原發(fā)突變?nèi)巳篖HON的發(fā)病; 單體型M10a與正常人群存在統(tǒng)計學差異, 并且發(fā)現(xiàn)該單體型家系外顯率較高, 提示線粒體單體型 M10a可能增加攜帶該原發(fā)突變家系外顯率; 發(fā)現(xiàn)m.2406A＞G這一新突變位點, 但是否為該病的繼發(fā)性突變需要進一步研究; 在各地區(qū)患者單體型分析中河南患者 3例, 2例屬于單體型M10a, 其他地區(qū)患者所屬單體型分布趨勢無明顯差別。在多數(shù)LHON家系, 同種線粒體單體型患者的發(fā)病年齡和視力損害程度不等以及男性多發(fā)的現(xiàn)象,提示除線粒體單體型和致病性突變以外, 可能與其他因素如核修飾基因[27～29]、環(huán)境因素[16～18]等相關,這些因素在該病的發(fā)生發(fā)展中的作用有待進一步研究。

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(責任編委: 夏昆)

The analysis of mitochondrial DNA haplogroups and variants for Leber’s hereditary optic neuropathy in Chinese families carrying the m.14484T＞C mutation

Xiangjuan Meng1,2, Jinping Zhu1,2, Min Gao1,2, Sai Zhang1,2, Fuxin Zhao2, Juanjuan Zhang5, Xiaoling Liu2, Qiping Wei3, Yi Tong2, Minglian Zhang4, Jia Qu2, Minxin Guan1,5

1. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Medical Genetics, Attardi Institute of Mitochondrial Biomedicine, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China;
2. School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027, China;
3. Dongfang Hospital, Beijing University of Chinese Medicine and Pharmacology, Beijing 100078, China;
4. Xingtai Eye Hospital, Hebei Province, Xingtai 054001, China;
5. Institute of Genetics, Zhejiang University, Hangzhou 310023, China

The m.14484T＞C mutation in mitochondrial ND6 gene (MT-ND6) is a primary mutation underlying the development of Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) , but by itself not enough to cause visual loss. To explore the role of mitochondrial haplogroups on the expression of LHON for the people carrying the m.14484T＞C mutation, we performed systematic and extended mutational screening of MT-ND6 gene in a cohort of 1177 Han Chinese patients with LHON. A total of 67 affected subjects carried the homoplasmic m.14484T＞C mutation, accounting for 5.7% of this LHON population. The penetrances of optic neuropathy among 51 pedigrees carrying the m.14484T＞C mutation ranged from 5.6% to 100.0%, with the average of 21.5%. The sequence analysis of entire mitochondrial genomes of 51 probands exhibited distinct sets of polymorphisms belonging to 18 Eastern Asian haplogroups. The frequencies of haplogroup A and haplogroup F were significantly less in the LHON mtDNA samples than those in 106 Chinese controls. On the other hand, the haplogroup M10a accounted for 9.8% of the patient’s mtDNA samples but was absent in 106 Chinese controls. Strikingly, the average penetrance (46.13%) of optic neuropathy for the pedigrees carrying mitochondrial haplogroup M10a was higher than those carrying other mtDNA haplogroups. These observations indicated that mitochondrial haplogroup M10a may increase the risk of visual loss.

Leber’s hereditary optic neuropathy(LHON); mitochondrial; mutation; haplogroup; penetrance

2013-09-23;

2013-10-28

國家自然科學基金項目(編號：81200724), 國家科技支撐計劃(編號：2012BAI09B03)和溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院創(chuàng)新引導課題(編號：YNCX201010)資助

孟祥娟, 在讀碩士研究生, 專業(yè)方向：臨床檢驗診斷學。E-mail: xiangjuanmeng002@163.com

管敏鑫, 教授, 博士生導師, 研究方向：人類遺傳學和線粒體病。E-mail: gminxin88@zju.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0336

時間: 2013-12-30 18:17:41

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20131230.1817.001.html