環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞適應(yīng)性突變

朱林江, 李崎

江南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心, 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無錫 214122

環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞適應(yīng)性突變

朱林江, 李崎

江南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心, 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無錫 214122

細(xì)胞具有普遍的突變和進(jìn)化能力, 如病原菌的抗藥性、工業(yè)菌株的適應(yīng)性和人體細(xì)胞的癌變等, 但是細(xì)胞的適應(yīng)性突變是如何產(chǎn)生的呢？通過非致死性突變分析模型的建立與應(yīng)用, 產(chǎn)生了新的適應(yīng)性進(jìn)化觀點(diǎn), 即環(huán)境脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性突變。這種環(huán)境誘導(dǎo)的細(xì)胞突變過程涉及多方面的生理調(diào)控, 包括細(xì)胞內(nèi)毒性物質(zhì)(如氧活性物質(zhì))積累并造成DNA損傷、DNA錯(cuò)配修復(fù)的活性受到抑制、胞內(nèi)RpoS反應(yīng)和SOS反應(yīng)被激活等。這些反應(yīng)使胞內(nèi)高保真的DNA復(fù)制狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅Ｕ娴腄NA修復(fù)狀態(tài), 提高胞內(nèi)突變率和重組活性。此外,基因轉(zhuǎn)錄影響基因組的不穩(wěn)定, 容易產(chǎn)生DNA損傷, 并造成局部的高突變率, 即形成了轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的DNA修復(fù)與突變?yōu)榛A(chǔ)的適應(yīng)性突變觀點(diǎn)。文章圍繞環(huán)境脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞突變率增加和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的DNA修復(fù)與突變這兩種適應(yīng)性突變分子機(jī)制, 闡述其相關(guān)的研究進(jìn)展, 以期更好地理解環(huán)境條件誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生適應(yīng)性突變的過程。

壓力誘導(dǎo)突變; 適應(yīng)性進(jìn)化; 超突變態(tài); 轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的DNA突變

傳統(tǒng)的達(dá)爾文進(jìn)化理論認(rèn)為, 生物進(jìn)化是生物個(gè)體發(fā)生變異后, 通過自然條件選擇的結(jié)果。生物的這種變異進(jìn)化現(xiàn)象普遍存在, 如：臨床上頻繁出現(xiàn)的病原菌抗藥性突變, 通過連續(xù)傳代獲得適應(yīng)性進(jìn)化的工業(yè)菌株, 人體細(xì)胞的癌變化以及免疫系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)產(chǎn)生新的抗體基因等。但是, 這些細(xì)胞突變是如何產(chǎn)生的？細(xì)胞的突變與外界的選擇環(huán)境是否有關(guān)？細(xì)胞的突變率是固定不變的、小幾率的,還是會(huì)被誘導(dǎo)增加的？這些問題涉及生物進(jìn)化的動(dòng)力和生物進(jìn)化論的核心問題, 目前仍未能被清晰解答[1]。早在20世紀(jì)40、50年代, Luria等[2]和Lederberg等[3]利用 E.coli獲得噬菌體抗性和抗生素抗性的突變模型, 并經(jīng)過數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析, 證明細(xì)胞的隨機(jī)突變速率是個(gè)常數(shù), 與環(huán)境無關(guān), 為以隨機(jī)突變?yōu)榛A(chǔ)的進(jìn)化理論奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ), 從而形成以DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的隨機(jī)突變?yōu)榛A(chǔ)的新達(dá)爾文進(jìn)化論(neo-Darwinism)的主流觀點(diǎn)。不過, 上述實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒捎昧酥滤佬缘倪x擇條件, 這種選擇性條件比較劇烈,其陽性突變主要來自于細(xì)胞分裂過程中的隨機(jī)突變。后來發(fā)展出非致死性選擇條件的突變分析模型,包括細(xì)菌的研究模型[4～6]、新發(fā)展的酵母研究模型[7]以及國(guó)內(nèi)學(xué)者構(gòu)建的細(xì)菌分析模型[8,9]。這些突變模型提高了突變分析的靈敏度, 能夠分析突變產(chǎn)生的胞內(nèi)生理過程, 并形成了壓力誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性突變的新進(jìn)化觀點(diǎn)[1,10～12], 即脅迫條件誘導(dǎo)細(xì)胞的生理變化, 使細(xì)胞的突變率增加, 產(chǎn)生易于突變的狀態(tài),促進(jìn)適應(yīng)性突變的產(chǎn)生。

盡管脅迫條件能夠誘導(dǎo)多種不同類型的基因突變, 包括少量堿基的改變、刪除或插入、基因拷貝數(shù)的改變、可移動(dòng)元件發(fā)生移動(dòng)以及大片段的基因組重排等, 但是適應(yīng)性突變的產(chǎn)生過程涉及了一些共同的分子機(jī)制[1]。本文總結(jié)了一些壓力條件誘導(dǎo)細(xì)胞突變的分析模型; 分析壓力誘導(dǎo)細(xì)胞突變的相關(guān)分子機(jī)制, 強(qiáng)調(diào)脅迫環(huán)境誘導(dǎo)胞內(nèi)高突變狀態(tài)的產(chǎn)生; 結(jié)合轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的DNA突變和修復(fù)機(jī)制, 形成環(huán)境條件誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性突變的分子機(jī)制。

1 非致死性選擇條件的突變分析模型

當(dāng)細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)匱乏等非致死性脅迫環(huán)境條件時(shí), 細(xì)胞處于緩慢生長(zhǎng)或靜止?fàn)顟B(tài), 但是細(xì)胞保持活性, 此時(shí)胞內(nèi)的突變率被誘導(dǎo)增加, 并易于產(chǎn)生適應(yīng)性突變。當(dāng)在脅迫條件中培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), 適應(yīng)性突變的細(xì)胞數(shù)量會(huì)不斷增加, 如 Lac-表型的回復(fù)突變、氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變和老化菌落中提高的突變能力等。

最早報(bào)道的適應(yīng)性突變分析模型是 Shapiro的E.coli系統(tǒng)[4]。該菌株攜帶 Mu噬菌體, 其插入到araB基因(L-核酮糖激酶)中, 抑制下游基因 lacZ和lacY的表達(dá), 使菌株表現(xiàn)為乳糖利用能力缺陷型(Lac-)。若將108個(gè)細(xì)胞涂布到乳糖的最小培養(yǎng)基表面, 在 3周培養(yǎng)過程中不斷出現(xiàn)生長(zhǎng)的菌落, 并布滿整個(gè)平板。若培養(yǎng)基中不含乳糖, 在 3周培養(yǎng)過程中細(xì)胞不會(huì)死亡, 但不能形成 AraB-LacZ+的突變菌落, 證明乳糖饑餓環(huán)境誘導(dǎo)發(fā)生適應(yīng)性突變。所以該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C實(shí)乳糖饑餓環(huán)境偏好性地誘導(dǎo)噬菌體Mu刪除突變, 形成araB-lacZ融合基因, 并通過araB的啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá), 獲得Lac+的突變表型。而非誘導(dǎo)性環(huán)境中或正常富集培養(yǎng)基中, Mu在基因組中穩(wěn)定存在, 其刪除突變率幾乎不可測(cè)。同樣的情況發(fā)生在另一株 E.coli菌中, 乳糖的饑餓脅迫同樣偏好性地誘導(dǎo)基因組上 ebg操縱子的突變, 從而積累 Lac+的表型[13]。除了乳糖饑餓脅迫外, 氨基酸的饑餓脅迫同樣偏好性地誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性突變的產(chǎn)生[12]。當(dāng)E.coli菌株色氨酸合成酶的α或β亞基發(fā)生突變, 表現(xiàn)為色氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型(Trp-)。在正常培養(yǎng)條件下, 菌株不能回復(fù)突變產(chǎn)生 Trp+的表型。當(dāng)細(xì)胞涂布于添加少量色氨酸的最小培養(yǎng)基上時(shí), 經(jīng)過10 d的培養(yǎng), 不斷有Trp+表型的菌落被誘導(dǎo)產(chǎn)生。所以, 色氨酸饑餓脅迫同樣偏好性地誘導(dǎo)色氨酸合成酶亞基的回復(fù)突變, 得到適應(yīng)性突變的表型。

以上乳糖回復(fù)突變和色氨酸回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)脅迫環(huán)境提升細(xì)胞的適應(yīng)性突變。在自然環(huán)境條件下, 微生物也總是處于營(yíng)養(yǎng)匱乏的條件, 那么天然的脅迫環(huán)境是否誘導(dǎo)細(xì)胞提升適應(yīng)性突變呢？天然分離菌株的突變能力是否與環(huán)境相關(guān)？對(duì)此, Bjedov等[14]從世界范圍(包括法國(guó)、墨西哥、委內(nèi)瑞拉、馬里、澳大利亞、克羅地亞以及南極)人或動(dòng)物的糞便、腸道中分離出787株天然E.coli菌株, 比較在固體培養(yǎng)基上形成老化菌落(即接近自然條件的營(yíng)養(yǎng)匱乏狀態(tài))后的突變率差異。通過比較培養(yǎng) 1 d的新生菌落和 7 d的老化菌落的利福平抗藥性突變率, 結(jié)果表明 7 d老化菌落的利福平抗藥性突變率顯著提高, 787株菌的老化菌落的突變率平均提高10倍, 其中13%的菌株突變率提高大于100倍[14]。這種老化菌落的突變率增加與細(xì)胞受饑餓脅迫密切相關(guān)。而不同環(huán)境中分離的菌株的突變率差異與它們的生存環(huán)境密切相關(guān), 而與系統(tǒng)發(fā)育樹上的親緣關(guān)系無關(guān)。同樣, 對(duì)天然分離的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)的突變能力分析表明[15], 其典型的高突變率遺傳背景與其脅迫性的生存環(huán)境相關(guān), 其中高濃度的氧活性物質(zhì)或氮活性物質(zhì)均顯著提高了基因突變率或遺傳重組活性。因此, 生存的環(huán)境條件與天然菌株的突變能力密切相關(guān)。

在眾多非致死性選擇條件的突變模型中, 20世紀(jì)80年代末Cairns和Foster開發(fā)的lac回復(fù)突變系統(tǒng), 即Cairns系統(tǒng), 被研究得最詳細(xì)[1,16]。該模型的模式菌株為 E.coli FC40, 其基因組上已經(jīng)突變刪除lac操作子, 引入的F′質(zhì)粒上攜帶lacI-lacZ的融合基因lacIΩZ, 該融合基因中間位置發(fā)生+1讀碼框突變,所以菌株表現(xiàn)為L(zhǎng)ac-。這個(gè)融合基因在突變的Iq啟動(dòng)子下組成型表達(dá)。正常條件下, 表達(dá)的融合蛋白具有1%～2%的β-半乳糖苷酶活性。該菌株在乳糖饑餓脅迫下, 可偏好性地誘導(dǎo)lacIΩZ讀碼框突變的回復(fù)突變或該融合基因的基因擴(kuò)增(50～100倍), 使Lac+菌落不斷出現(xiàn)。Lac+菌落數(shù)的增加與培養(yǎng)時(shí)間大致呈線性關(guān)系。這些回復(fù)突變菌落的基因型主要分為兩類：(1) 點(diǎn)突變, 即 lacIΩZ基因內(nèi)部發(fā)生點(diǎn)突變(包括缺失和插入), 回復(fù)形成正確的讀碼框; (2)基因擴(kuò)增, 包含 lacIΩZ基因的片段單元(大小不一)在細(xì)胞內(nèi) 50～100倍的擴(kuò)增, 從而過量表達(dá)具有1%～2%的 β-半乳糖苷酶活性的融合蛋白, 恢復(fù)細(xì)胞利用乳糖的能力[17]。這些回復(fù)突變的產(chǎn)生, 只有在乳糖為唯一碳源的饑餓脅迫條件時(shí)才會(huì)發(fā)生, 證明了乳糖饑餓條件的誘導(dǎo)作用。由于Cairns模型能夠靈敏地定量分析細(xì)胞的適應(yīng)性突變過程, 所以被廣泛地用于研究壓力誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性突變的分子機(jī)制。

2 壓力誘導(dǎo)細(xì)胞突變的相關(guān)分子機(jī)制

微生物突變實(shí)驗(yàn)表明非致死性的選擇條件能夠偏好性地誘導(dǎo)相關(guān)基因發(fā)生適應(yīng)性突變, 而且這種遺傳突變發(fā)生在緩慢生長(zhǎng)的細(xì)胞中[12,18]。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), 突變細(xì)胞的數(shù)量不斷增加, 如 Cairns系統(tǒng)的 Lac+回復(fù)突變率大致呈線性增長(zhǎng)的趨勢(shì)[6]。所以, 壓力誘導(dǎo)細(xì)胞突變與DNA復(fù)制過程產(chǎn)生的隨機(jī)突變存在顯著的差異, 前者的適應(yīng)性突變率提高102～103倍。研究表明, 多個(gè)分子機(jī)制涉及壓力誘導(dǎo)細(xì)胞突變的過程[10,19～21], 如圖1所示。

圖1 壓力誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性突變的分子機(jī)制當(dāng)細(xì)胞受到環(huán)境脅迫, 胞內(nèi)積累有毒物質(zhì)而造成 DNA損失, 如基因組上的單鏈缺口或雙鏈斷鏈(Double-strand break, DSB), 誘導(dǎo)了胞內(nèi)抗脅迫反應(yīng)、SOS反應(yīng)和高活性的DNA重組反應(yīng)[10,21],導(dǎo)致細(xì)胞的突變率增加[22]; 環(huán)境誘導(dǎo)的高活性基因轉(zhuǎn)錄增加該區(qū)域基因組的不穩(wěn)定性, 表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄區(qū)的超突變特征[19,20]; 這些生理反應(yīng)的共同累積, 使細(xì)胞形成超突變態(tài), 少量細(xì)胞獲得適應(yīng)性突變而具備生長(zhǎng)能力。

2.1 胞內(nèi)有毒物質(zhì)的積累和損傷DNA的積累

當(dāng)細(xì)胞處于正常條件時(shí), 胞內(nèi)代謝迅速, DNA復(fù)制高保真, 細(xì)胞保持較低的突變率。當(dāng)細(xì)胞處于脅迫環(huán)境時(shí), 胞內(nèi)代謝受到抑制, 容易積累有毒物質(zhì), 如氧活性物質(zhì)(Reactive oxygen species, ROS)和被修飾的核苷酸, 造成 DNA的損傷; 積累了 DNA單鏈缺口或雙鏈斷裂, 誘導(dǎo)細(xì)胞的生理狀態(tài)變化。胞內(nèi)有毒物質(zhì)和損傷 DNA的積累被認(rèn)為是壓力誘導(dǎo)細(xì)胞突變的起始階段[10,21], 如圖1所示。如Bjedov等[14]分析表明, 自然界分離的E. coli菌株在菌落老化階段的突變率顯著提高, 與有氧培養(yǎng)條件密切相關(guān)。老化菌落中的細(xì)胞代謝活性較弱, 在有氧條件下, 胞內(nèi)容易積累ROS, 增加DNA的損傷, 從而提高細(xì)胞的突變率。針對(duì)抗生素脅迫條件下細(xì)胞如何死亡的最新研究結(jié)果也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。當(dāng)胞內(nèi)代謝受到致死性的抗生素濃度阻礙時(shí), 胞內(nèi)積累大量的ROS和氧化的核苷酸, 使DNA損傷增加, 在修復(fù)型DNA聚合酶Pol Ⅳ作用后, 產(chǎn)生了大量的DNA雙鏈斷裂并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[23]。但若降低抗生素的濃度, 即亞致死濃度的脅迫條件下, ROS對(duì)DNA的損傷程度減弱, 則誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生多種抗藥性突變[24]。而在Cairns模型系統(tǒng)中, Lac+回復(fù)突變率與F′質(zhì)粒上能夠產(chǎn)生由內(nèi)切酶TraⅠ介導(dǎo)的單鏈DNA缺口密切相關(guān); 若刪除traI基因, Lac+回復(fù)突變率降低130倍[25]。若在lacIΩZ基因上游或下游人工引入可誘導(dǎo)的雙鏈斷裂位點(diǎn), 能夠有效地提高 Lac+回復(fù)突變率約 50倍[25], 這種誘導(dǎo)性同樣在染色體基因組中適用[26]。所以, 當(dāng)細(xì)胞處于脅迫環(huán)境中時(shí), 胞內(nèi)有毒物質(zhì)的積累和損傷DNA的積累成為直接因素, 誘導(dǎo)胞內(nèi)突變率的提高, 促進(jìn)適應(yīng)性突變的產(chǎn)生[10,21]。

2.2 限制性修復(fù)系統(tǒng)MMR的調(diào)控

脅迫條件誘導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)性突變的過程中, MMR (Mismatch repair)活性的調(diào)控起到重要的作用。MMR是進(jìn)化上非常保守的DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng), 能夠校正DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的錯(cuò)配堿基, 提高 DNA復(fù)制的保真性近1000倍[27]。若MMR活性缺失, 細(xì)胞表現(xiàn)出高突變和高重組的表型, 其隨機(jī)突變率提高近100倍; 胞內(nèi)的一些微衛(wèi)星重復(fù)序列非常不穩(wěn)定, 易于重組, 且胞內(nèi)基因組上易于整合外源的DNA[27,28]。MMR系統(tǒng)主要包括3個(gè)核心蛋白, MutS、MutL和MutH。MutS識(shí)別錯(cuò)配堿基, 并募集 MutL, 形成的復(fù)合物激活核酸內(nèi)切酶MutH, 同時(shí)MutL募集解螺旋酶, 復(fù)合體共同作用降解未甲基化的新生的錯(cuò)配DNA鏈, 形成的DNA缺口由DNA聚合酶和連接酶完成修復(fù)[28]。在對(duì)數(shù)期的細(xì)胞中, MMR活性正常表達(dá), 保證細(xì)胞處于高保真的DNA合成狀態(tài)和較低的隨機(jī)突變率。當(dāng)進(jìn)入穩(wěn)定期或細(xì)胞處于脅迫環(huán)境下,胞內(nèi)的MMR活性被下調(diào), 其中關(guān)鍵蛋白MutL功能受到限制, 細(xì)胞的突變率顯著增加[29]。所以, MMR活性的調(diào)控與胞內(nèi)基因組突變率的變化密切相關(guān)。以 Cairns系統(tǒng)為例, 若組成型缺失 MMR活性, 使Lac+適應(yīng)性回復(fù)突變率提高 100倍; 若人為上調(diào)MMR活性, 則顯著降低Lac+突變率[29,30]。此外, 在天然菌株的適應(yīng)性進(jìn)化上, MMR活性的調(diào)控也具有重要意義。MMR組成型缺失的天然菌株也經(jīng)常被分離得到, 表現(xiàn)出更好的適應(yīng)性進(jìn)化能力[31], 如上文提及的幽門螺桿菌[15]。通過系統(tǒng)發(fā)育樹比較分析許多天然菌株的 MMR, 結(jié)果表明這些基因具有典型的鑲嵌結(jié)構(gòu), 這可能源于高頻率基因水平轉(zhuǎn)移的結(jié)果[32]。本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果表明, MMR功能被組成型突變的菌株, 能更迅速地適應(yīng)高滲透壓、高溫和高丁醇的脅迫環(huán)境[33]。所以, MMR活性的反復(fù)缺失與獲得, 及其在胞內(nèi)的調(diào)控, 在生物進(jìn)化中可能起到關(guān)鍵作用[32]。

2.3 抵抗環(huán)境脅迫的胞內(nèi)生理反應(yīng)

細(xì)胞往往通過改變轉(zhuǎn)錄程序、改變自身的生理狀態(tài)適應(yīng)不同的環(huán)境條件。如在E.coli中存在7個(gè)σ因子, 結(jié)合RNA聚合酶, 識(shí)別不同類型基因的啟動(dòng)子, 根據(jù)外界環(huán)境決定基因的表達(dá)。其中σ70或RpoD在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期發(fā)揮作用, 并控制大部分看家基因的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期或處于脅迫環(huán)境下, RpoD 將被 RpoS(σ38)取代, 激活壓力反應(yīng)(General stress response), 直接或間接地調(diào)控近340個(gè)基因的表達(dá)(包括關(guān)閉合成代謝的基因), 上調(diào)抗脅迫反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá), 用以抵抗胞外的營(yíng)養(yǎng)缺乏、熱脅迫、滲透壓脅迫、不適pH脅迫以及氧化脅迫等[34]。此外, RpoS反應(yīng)也參與胞內(nèi)突變率的調(diào)控, 當(dāng)缺失RpoS反應(yīng)時(shí), Cairns系統(tǒng)中的Lac+回復(fù)突變率降低10倍[35,36]。作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, RpoS蛋白不能直接參與基因突變過程, 推測(cè)其調(diào)控的一些蛋白參與了基因突變的產(chǎn)生過程, 如修復(fù)型的易錯(cuò)DNA聚合酶IV(DinB)。RpoS反應(yīng)能夠誘導(dǎo)并提高DinB的合成約2倍[35]。DinB是一種易錯(cuò)DNA聚合酶, 被認(rèn)為直接參與 Lac+的適應(yīng)性點(diǎn)突變, 這是由于 lac適應(yīng)性點(diǎn)突變一般是在lacIΩZ基因內(nèi)部發(fā)生-1讀碼框的回復(fù)突變, 而這種突變類型恰好是DinB的偏好性突變產(chǎn)物[37,38]。但是, 也有研究認(rèn)為DinB與適應(yīng)性突變無關(guān)[39], 且一些菌株中不含該類型的 DNA聚合酶[15]。此外, RpoS反應(yīng)的上調(diào)提高了DNA雙鏈斷裂處的重組修復(fù)突變率[25]。

另一個(gè)被證明參與Lac+適應(yīng)性回復(fù)突變的σ因子是σE, 即RpoE蛋白。RpoE反應(yīng)屬于外膜應(yīng)激反應(yīng), 如外膜蛋白失活或折疊錯(cuò)誤等, 控制胞內(nèi)近200個(gè)基因的表達(dá)。大部分基因涉及脂多糖的合成、組裝和動(dòng)態(tài)變化等, 在維持細(xì)胞完整性上發(fā)揮重要功能; 其余一部分基因涉及蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯, 以及DNA的合成和修復(fù)[40]。最近的研究表明, 通過轉(zhuǎn)座子插入, 使σE失活, FC40菌株的Lac+回復(fù)突變率減少 11～15倍, 其中 Lac+回復(fù)突變的基因擴(kuò)增型突變子減少近300倍, 即σE的失活嚴(yán)重抑制胞內(nèi)基因擴(kuò)增的突變產(chǎn)生[41]。σE被認(rèn)為參與兩種分子機(jī)制：(1)σE的缺失, 降低核酸內(nèi)切酶 TraⅠ的表達(dá)水平, 從而減少 F′質(zhì)粒產(chǎn)生 TraⅠ依賴的單鏈缺口, 使 Lac+回復(fù)突變率降低。通過過量表達(dá) I-SceⅠ, 誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生DSB, 能夠補(bǔ)償σE的缺失, 恢復(fù)約80%的突變率; (2)σE的缺失嚴(yán)重降低基因擴(kuò)增的突變基因型, 表明σE以一種未知機(jī)制影響lacIΩZ等位基因的擴(kuò)增[41]。

2.4 胞內(nèi)SOS反應(yīng)

胞內(nèi)積累過量損傷的DNA時(shí), 激活胞內(nèi)的SOS反應(yīng), 提高DNA修復(fù)能力。其過程是RecA與損傷的單鏈DNA(Single-strand DNA, ssDNA)形成復(fù)合物,降解阻遏蛋白LexA, 誘導(dǎo)SOS反應(yīng), 上調(diào)近40個(gè)基因表達(dá)。這些基因涉及DNA修復(fù)、細(xì)胞分裂控制、跨損傷合成的DNA聚合酶等[42]。如E. coli中, Y-家族兩個(gè)典型的修復(fù)型 DNA聚合酶 Pol IV(DinB)和PolⅤ(UmuD′2C)以及PolⅡ均是受 SOS反應(yīng)調(diào)控。從細(xì)菌到動(dòng)物, Y-家族的DNA聚合酶都是非常保守的, 具有跨損傷合成DNA的能力, 增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)DNA損傷的耐受性。但是, 當(dāng)它們作用于正常的DNA模板時(shí), 易于產(chǎn)生突變, 不具有校正功能, 所以被稱為易錯(cuò)DNA聚合酶[43,44], 與突變的產(chǎn)生密切相關(guān)。一些菌株的抗生素抗性突變依賴于SOS反應(yīng)。若抑制胞內(nèi)SOS反應(yīng), 則會(huì)減弱細(xì)胞的抗生素抗性突變,這種SOS介導(dǎo)的突變可能涉及易錯(cuò)DNA聚合酶的調(diào)控[45]。SOS反應(yīng)增加突變率可能由于高活性低保真的DNA修復(fù)和重組。SOS反應(yīng)上調(diào)近10倍的DinB。當(dāng)DinB作用于完好的DNA模板時(shí), 易于產(chǎn)生-1讀碼框突變。在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞中, 這種突變?nèi)菀妆?MMR系統(tǒng)修復(fù)。而穩(wěn)定期或受環(huán)境脅迫的細(xì)胞中, MMR功能則受到限制, 所以容易產(chǎn)生可遺傳的基因突變。若刪除 dinB基因, Lac+回復(fù)突變細(xì)胞率則降低至原來的 25%[46,47]。胞內(nèi) RecA依賴的同源重組功能是發(fā)生壓力誘導(dǎo)的Lac+回復(fù)突變或環(huán)丙沙星誘導(dǎo)的細(xì)胞突變所必須 的[6,45]。在正常條件時(shí),雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)是高保真的。而當(dāng)胞內(nèi)的SOS反應(yīng)被激活后, 過量上調(diào)的易錯(cuò)DNA聚合酶使同源重組修復(fù)趨向基因突變的產(chǎn)生。所以, SOS反應(yīng)的激活提高胞內(nèi)修復(fù)損失DNA的活性, 增加細(xì)胞對(duì)DNA損失耐受性, 同時(shí)提高了細(xì)胞的突變能力[1,11]。

3 壓力誘導(dǎo)細(xì)胞生理狀態(tài)的躍遷

采用以上描述的非致死性選擇條件的突變分析模型表明, 細(xì)胞的基因突變的主要來源并非是細(xì)胞快速生長(zhǎng)過程中的DNA復(fù)制錯(cuò)誤, 而是源于緩慢生長(zhǎng)的細(xì)胞自身誘發(fā)的適應(yīng)性突變。其實(shí), 這種緩慢生長(zhǎng)狀態(tài)更加接近于自然界微生物生存的狀態(tài), 而且被證明可用于適應(yīng)性進(jìn)化的菌種改良[33]。細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)與突變率密切相關(guān)。當(dāng)在富營(yíng)養(yǎng)條件時(shí),細(xì)胞快速生長(zhǎng), 胞內(nèi)有毒化學(xué)物質(zhì)積累的濃度較低,胞內(nèi)保持較高的MMR活性, 實(shí)現(xiàn)高保真的DNA復(fù)制并合成子代DNA, 所以基因組的突變率微小。但是, 當(dāng)細(xì)胞處于脅迫環(huán)境中, 如營(yíng)養(yǎng)缺乏的穩(wěn)定期階段時(shí), 細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)緩慢, 容易積累有毒化學(xué)物質(zhì), 造成大量的 DNA損失, 誘導(dǎo) SOS反應(yīng)和RpoS反應(yīng), 胞內(nèi)的生理狀態(tài)由原來高保真狀態(tài)躍遷至低保真狀態(tài), 易產(chǎn)生突變[1,10]。因此, 壓力誘導(dǎo)細(xì)胞突變的過程中, 涉及典型的突變狀態(tài)躍遷, 如圖2所示。

圖 2 壓力誘導(dǎo)細(xì)胞突變過程中涉及的胞內(nèi)突變狀態(tài)躍遷正常生長(zhǎng)的細(xì)胞, 其代謝迅速, 不易積累過量的有毒物質(zhì), DNA損傷程度較低, 錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)MMR活性正常, 細(xì)胞處于高保真的DNA合成狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到環(huán)境脅迫, 胞內(nèi)容易積累毒性物質(zhì)而造成DNA過度損傷, 誘導(dǎo)胞內(nèi)的易于突變的生理狀態(tài)[1,21,25]。

若E.coli胞內(nèi)同時(shí)誘導(dǎo)激活RpoS反應(yīng)和SOS反應(yīng), 細(xì)胞被認(rèn)為處于超突變(Hypermutation)狀態(tài)[1]。E.coli FC40在乳糖的M9平板上出現(xiàn)的大部分Lac+回復(fù)突變菌落被認(rèn)為來源于超突變態(tài)細(xì)胞誘導(dǎo)過程。這種高突變能力除了表現(xiàn)在高 Lac+回復(fù)突變率外, 同時(shí)其二級(jí)非選擇性的突變率比 Lac-細(xì)胞平均提高了約50倍, 這種提高的隨機(jī)突變率被稱為短暫的超突變狀態(tài)[48,49]。Rosche等[49]研究表明, 這些超突變態(tài)細(xì)胞的出現(xiàn)概率約為 10-3, 而胞內(nèi)的突變率比正常細(xì)胞提高約200倍。根據(jù)該結(jié)果, Foster[50]推算只有10%的Lac+回復(fù)突變細(xì)胞來自于超突變態(tài)。Torkelson等[48]則認(rèn)為, Lac+回復(fù)突變細(xì)胞應(yīng)全都來自于超突變態(tài)細(xì)胞, 產(chǎn)生超突變態(tài)細(xì)胞的概率應(yīng)是10-4～10-3, 所以超突變態(tài)細(xì)胞的突變率應(yīng)該提高104～106倍。盡管Roth等[51]提出反駁, 若胞內(nèi)的突變率比正常細(xì)胞高105倍, 會(huì)導(dǎo)致基因組積累過多的無義突變而使細(xì)胞死亡, 但 Cairns等[52]則認(rèn)為, 如果壓力誘導(dǎo)突變率的提高集中在特殊的基因組區(qū)域,則突變率提高到正常條件的 105倍是可能的, 如E.coli FC40細(xì)胞發(fā)生Lac+回復(fù)突變時(shí), F′質(zhì)粒上的突變率高于基因組。目前這種超突變態(tài)假說仍缺乏直接的證據(jù)。另一種不同于超突變態(tài)假說的觀點(diǎn)是基因擴(kuò)增假說, 從基因擴(kuò)增角度解釋基因突變產(chǎn)生的過程[16,53]。不管基因突變產(chǎn)生于DNA修復(fù)過程還是基因擴(kuò)增過程, 但是, 當(dāng)細(xì)胞處于脅迫環(huán)境時(shí),細(xì)胞的生理狀態(tài)發(fā)生變化是必然發(fā)生的。這種狀態(tài)躍遷提高了胞內(nèi)DNA修復(fù)和重組活性, 同時(shí)增加了基因組突變率, 從而促進(jìn)壓力誘導(dǎo)的突變[22]。

4 轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的DNA突變與修復(fù)

上述的非致死性突變模型中, 特殊基因的高突變率被偏好性地誘導(dǎo), 這種適應(yīng)性突變現(xiàn)象可能涉及轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的DNA突變過程。當(dāng)細(xì)胞處于特殊的脅迫環(huán)境時(shí), 胞內(nèi)誘導(dǎo)啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),同時(shí)關(guān)閉其他基因; 由于代謝受到抑制, 胞內(nèi)積累過量的毒性物質(zhì), 容易造成DNA損傷; 基因轉(zhuǎn)錄增加 DNA的不穩(wěn)定性[20], 如產(chǎn)生單鏈 DNA, 容易受到酶或其他毒性物質(zhì)的攻擊, 產(chǎn)生缺口; 轉(zhuǎn)錄過程與復(fù)制過程沖撞時(shí), 在DNA鏈中容易滲入dUTP隨后產(chǎn)生缺口[54]; 壓力誘導(dǎo)的低保真的 DNA聚合酶過量積累, 細(xì)胞處于突變狀態(tài), 所以, 轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的DNA突變機(jī)制使細(xì)胞在脅迫環(huán)境下提高基因組上應(yīng)激表達(dá)的轉(zhuǎn)錄區(qū)的突變率, 造成基因組范圍內(nèi)突變率的非均一性分布, 表現(xiàn)為較高的適應(yīng)性突變特征[55]。已有證據(jù)表明基因轉(zhuǎn)錄頻率的提高, 基因突變率也隨之提高。例如在酵母菌中, 移碼突變基因lys2在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下分析其回復(fù)突變率, 結(jié)果表明回復(fù)突變率與基因轉(zhuǎn)錄頻率具有顯著相關(guān)性[56]。在E.coli中, 氨基酸合成途徑中的酶(leuB)發(fā)生突變失活, 造成氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。若加速該突變基因的轉(zhuǎn)錄頻率, 則能有效地提高該基因的回復(fù)突變率, 即 leuB-的回復(fù)突變率與細(xì)胞內(nèi) leuB-的mRNA水平成正比關(guān)系[57]。

轉(zhuǎn)錄偶聯(lián) DNA適應(yīng)性突變的分子機(jī)制仍缺乏直接的證據(jù)。Wright[58]認(rèn)為涉及轉(zhuǎn)錄過程誘導(dǎo)單鏈DNA形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)突變率增加起到重要作用, 并通過計(jì)算預(yù)測(cè), 頸環(huán)結(jié)構(gòu)可提高基因的突變率。動(dòng)物細(xì)胞的免疫球蛋白基因中, 轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的基因組重組和突變也已被研究[59,60]。最近麻省理工學(xué)院的一個(gè)研究組發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄延伸因子 NusA 的新功能[61～63],即當(dāng)轉(zhuǎn)錄機(jī)器RNAP在延伸過程遇到缺口時(shí), NusA能夠富集跨損傷修復(fù)型DNA聚合酶DinB, 即PolⅥ。若消除NusA與DinB的相互作用, 壓力誘導(dǎo)的 lac回復(fù)突變率顯著降低。根據(jù)NusA在DNA修復(fù)過程中的新功能, 可將壓力誘導(dǎo)突變理論與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的DNA修復(fù)與突變機(jī)制相結(jié)合, 建立基因轉(zhuǎn)錄與基因復(fù)制、修復(fù)和突變之間的關(guān)系, 使胞內(nèi)的DNA代謝與RNA代謝之間相互聯(lián)系[64], 從而形成了脅迫環(huán)境能夠誘導(dǎo)的基因組范圍的適應(yīng)性突變理論, 但是該理論仍需要實(shí)驗(yàn)的直接證據(jù)。

5 結(jié) 語

早在150年前達(dá)爾文就提出自然選擇的生物進(jìn)化論, 認(rèn)為生物進(jìn)化是生物個(gè)體發(fā)生變異、自然選擇的結(jié)果。20世紀(jì)40～50年代, 通過經(jīng)典的隨機(jī)突變實(shí)驗(yàn)確認(rèn)細(xì)胞的基因突變出現(xiàn)在選擇之前, 突變率是一個(gè)常數(shù), 與選擇環(huán)境無關(guān), 形成新達(dá)爾文主義的觀點(diǎn)。但是, 近年來, 改進(jìn)突變分析模型, 并采用非致死性選擇條件后, 細(xì)胞的突變率被證實(shí)不是一個(gè)常數(shù), 而是一個(gè)變量, 而且環(huán)境的選擇性條件可偏好性誘導(dǎo)適應(yīng)性突變。所以, 外界的環(huán)境條件被認(rèn)為能夠誘導(dǎo)基因突變, 從而促進(jìn)生物的進(jìn)化。這種新的適應(yīng)性進(jìn)化論觀點(diǎn)仍存在爭(zhēng)議, 主要集中于基因突變產(chǎn)生的過程, 即基因突變是在什么時(shí)間、哪一步反應(yīng)產(chǎn)生以及怎樣的過程中產(chǎn)生等。隨著脅迫環(huán)境誘導(dǎo)細(xì)胞突變過程的深入研究, 形成了細(xì)胞突變被誘導(dǎo)產(chǎn)生的觀點(diǎn); 即當(dāng)細(xì)胞處于脅迫條件時(shí), 細(xì)胞生長(zhǎng)速率緩慢, 胞內(nèi)容易積累有毒物質(zhì),從而導(dǎo)致胞內(nèi)產(chǎn)生大量的損傷DNA; 這些有毒物質(zhì)和損傷的DNA會(huì)激活胞內(nèi)的壓力脅迫反應(yīng)和 SOS反應(yīng); 細(xì)胞的DNA合成由原來的高保真復(fù)制狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐子谕蛔兊男迯?fù)狀態(tài), 從而產(chǎn)生適應(yīng)性突變。而針對(duì)脅迫環(huán)境偏好性誘導(dǎo)適應(yīng)性突變產(chǎn)生的問題,本文提出將轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的 DNA修復(fù)突變機(jī)制與壓力誘導(dǎo)細(xì)胞突變狀態(tài)躍遷相結(jié)合的適應(yīng)性突變假說：即脅迫環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)相關(guān)基因的高水平轉(zhuǎn)錄; 同時(shí)誘導(dǎo)高突變狀態(tài), 導(dǎo)致高轉(zhuǎn)錄區(qū)轉(zhuǎn)變?yōu)楦咄蛔儏^(qū), 使環(huán)境條件誘導(dǎo)的基因具有高突變率, 最終易于產(chǎn)生適應(yīng)性突變, 釋放細(xì)胞的壓力, 恢復(fù)高保真的正常狀態(tài)。但是這種假說仍需要進(jìn)一步研究有關(guān)轉(zhuǎn)錄區(qū)域易于適應(yīng)性突變的直接證據(jù)。

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(責(zé)任編委: 李紹武)

Stress-induced cellular adaptive mutagenesis

Linjiang Zhu, Qi Li

The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

The adaptive mutations exist widely in the evolution of cells, such as antibiotic resistance mutations of pathogenic bacteria, adaptive evolution of industrial strains, and cancerization of human somatic cells. However, how these adaptive mutations are generated is still controversial. Based on the mutational analysis models under the nonlethal selection conditions, stress-induced cellular adaptive mutagenesis is proposed as a new evolutionary viewpoint. The hypothetic pathway of stress-induced mutagenesis involves several intracellular physiological responses, including DNA damages caused by accumulation of intracellular toxic chemicals, limitation of DNA MMR (mismatch repair) activity, upregulation of general stress response and activation of SOS response. These responses directly affect the accuracy of DNA replication from a high-fidelity manner to an error-prone one. The state changes of cell physiology significantly increase intracellular mutation rate and recombination activity. In addition, gene transcription under stress condition increases the instability of genome in response to DNA damage, resulting in transcription-associated DNA mutagenesis. In this review, we summarize these two molecular mechanisms of stress-induced mutagenesis and transcription-associated DNA mutagenesis to help bet-ter understand the mechanisms of adaptive mutagenesis.

stress-induced mutagenesis; adaptive evolution; hypermutation; transcription-associated DNA mutagenesis

2013-09-04;

2013-12-23

2013基本科研-青年基金項(xiàng)目(編號(hào)：1012050205134030)和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資金(編號(hào)：JUSRP51306A)資助

朱林江, 博士, 副教授, 研究方向：微生物生理及其改造。Tel: 0510-85918176; E-mail: zlj@jiangnan.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0327

時(shí)間: 2014-3-27 14:29:48

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140327.1429.001.html