豬13號染色體上拷貝數(shù)變異區(qū)內(nèi)基因信息發(fā)掘及遺傳規(guī)律分析

劉靜, 王亞楠, 孫亞奇, 王洪洋, 汪超, 彭中鎮(zhèn), 劉榜

華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院, 農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室, 武漢 430070

豬13號染色體上拷貝數(shù)變異區(qū)內(nèi)基因信息發(fā)掘及遺傳規(guī)律分析

劉靜, 王亞楠, 孫亞奇, 王洪洋, 汪超, 彭中鎮(zhèn), 劉榜

華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院, 農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室, 武漢 430070

拷貝數(shù)變異(Copy number variation, CNV)是染色體上發(fā)生的一種微結(jié)構(gòu)變異, 已引起越來越多研究者的關(guān)注。本課題組前期已獲得豬13號染色體上的32個CNV區(qū)域(CNV region, CNVR), 為了發(fā)掘CNVR內(nèi)的基因信息, 文章在線檢索了上述CNVR內(nèi)的基因并進行基因本體(Gene Ontology)分析。結(jié)果共發(fā)現(xiàn)236個基因, 其中有注釋基因169個, 主要參與蛋白質(zhì)水解、細胞粘附、大分子降解等生物過程。為了探索這些基因拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律, 文章選擇RCAN1(Regulators of calcineurin 1)基因為候選基因, 利用QPCR方法在萊蕪豬群中檢測了該基因的拷貝數(shù), 并分析了CNV在萊蕪豬3個家系中的遺傳規(guī)律。結(jié)果表明, RCAN1基因在萊蕪豬群體中存在拷貝數(shù)的缺失、重復(fù)現(xiàn)象, 其拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律符合孟德爾遺傳方式。

拷貝數(shù)變異; 13號染色體; RCAN1基因; 遺傳規(guī)律; 萊蕪豬

拷貝數(shù)變異(Copy number variation, CNV)是指與生物正常的基因組序列(或參考基因組序列)相比,基因組中所發(fā)生的長度在1 kb至數(shù)Mb之間的變異,其形式包括重復(fù)、缺失、插入、易位及衍生出的染色體結(jié)構(gòu)變異[1]。由于CNV長度跨度較大, 以致它可以包含一個基因或基因的一部分, 也可以跨越多個基因, 在基因組中覆蓋的核苷酸總數(shù)遠遠超過單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)總數(shù)。研究發(fā)現(xiàn), CNV可以通過劑量效應(yīng)改變基因的表達量[2], 也可以影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控從而影響基因的表達[3,4], 它對表型變異的潛在影響可能要比SNP的影響更大。本課題組余少波等[5]利用豬60K SNP芯片技術(shù)在中外9個豬品種和1個雜種群體(杜洛克豬×通城豬)中發(fā)現(xiàn)了大量拷貝數(shù)變異區(qū)域(Copy number variation region, CNVR), 繪制了中外豬品種的全基因組CNV圖譜, 發(fā)現(xiàn)豬13號染色體(Sus scrofa chromosome 13, SSC13)上存在32個CNVR。其中萊蕪豬尤其特殊, 在13號染色體上存在大范圍的染色體缺失或重復(fù)區(qū)域, 但是未對SSC13上32個CNVR存在的真實性、它們的分類與長度分布、具有Ensembl ID基因與注釋基因的個數(shù)及拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律進行探究。

本研究在課題組前期研究基礎(chǔ)上, 分析計算SSC13上CNVR的分類及長度分布; 利用生物信息學方法檢索SSC13上32個CNVR內(nèi)的基因并分析其功能; 選擇鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶調(diào)節(jié)因子1(Regulators of calcineurin 1, RCAN1)基因為候選基因, 利用QPCR方法在 38頭萊蕪豬中檢測該基因的拷貝數(shù),并在該品種3個家系共15個個體中對該基因拷貝數(shù)變異進行遺傳規(guī)律分析。

1 材料和方法

1.1 材料

檢測RCAN1基因拷貝數(shù)所用DNA樣品來自山東省萊蕪市萊蕪豬原種場38頭萊蕪豬的耳組織, 并用杜洛克豬作為參考基因組。

萊蕪豬的A、B、C 3個家系用于分析RCAN1基因拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律。A、B家系均包含父本、母本及3個子代個體, C家系包含父本、母本及4個子代個體。B、C為同父異母的半同胞家系。

1.2 豬13號染色體上CNVR內(nèi)基因的發(fā)掘與其功能預(yù)測方法

利用 Ensembl中的 BioMart工具(http://asia. ensembl.org/biomart/martview/)檢索SSC13上CNVR內(nèi)的基因信息。應(yīng)用基因本體(Gene Ontology, GO)數(shù)據(jù)庫(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)將豬 CNVR內(nèi)的基因與人的基因進行同源比對, 根據(jù)同源基因產(chǎn)物的生物學功能、所參與的生物學過程等信息, 預(yù)測SSC13上CNVR中的基因功能。

1.3 利用 QPCR方法檢測萊蕪豬 13號染色體上RCAN1基因的拷貝數(shù)

通過檢索SSC13上CNVR內(nèi)的基因, 發(fā)現(xiàn)RCAN1基因位于 CNVR內(nèi), 并且其功能與免疫相關(guān), 但是豬中尚無該基因的研究報道, 本研究利用 QPCR方法在38頭萊蕪豬群體中檢測RCAN1基因的拷貝數(shù)。

1.3.1 引物設(shè)計

從Ensembl數(shù)據(jù)庫(http://asia.ensembl.org/index. html)中獲取RCAN1基因(ENSSSCG00000012050)的全長序列, 用Primer5.0設(shè)計4對引物, 引物位于該基因的上游和下游(表1)。10 μL反應(yīng)體系包括：1 μL DNA模板, 上下游引物各0.2 μL, Taq DNA聚合酶(Biotium公司)0.1 μL, dNTP混合物0.3 μL, PCR緩沖液1 μL, 加雙蒸水至10 μL。PCR擴增程序：95℃ 5 min; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 15 s, 34個循環(huán); 最后再72℃延伸5 min。取4 μL PCR擴增產(chǎn)物, 用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的片段, 通過測序驗證引物的擴增準確性。

表1 RCAN1基因PCR擴增引物信息

1.3.2 QPCR擴增

QPCR采用SYBR Green相對定量的方法, 以萊蕪豬基因組 DNA為模板, 以胰高血糖素(Glucagon, GCG)基因為內(nèi)參基因[6], 用RCAN1S1A1擴增RCAN1基因, 每個個體 3次重復(fù)。反應(yīng)體系按照 Real-time PCR Master Mix (TOYOBO, Japan)說明書進行, 反應(yīng)體積為10 μL。擴增程序：95℃ 5 min; 94℃ 30 s, 60℃30 s, 72℃ 15 s, 34個循環(huán); 最后再72℃延伸5 min。

1.3.3 RCAN1基因拷貝數(shù)的估計

以 2-ΔΔCt為基礎(chǔ), 利用公式：拷貝數(shù)=21-ΔΔCt對QPCR結(jié)果進行計算, 采用四舍五入方法對基因拷貝數(shù)進行估計。正常個體中, RCAN1基因拷貝數(shù)與內(nèi)參基因相同, 即 2個拷貝; 具有 CNV的個體中,該基因拷貝數(shù)會發(fā)生增加或缺失。

1.4 RCAN1基因拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律分析

以CNVR內(nèi)的RCAN1基因為候選基因, 以3個萊蕪豬家系為材料, 利用 QPCR方法檢測該基因拷貝數(shù), 分析每條染色體上可能含有的拷貝數(shù)情況,判斷RCAN1基因的拷貝數(shù)變異在3個萊蕪豬家系中是否符合孟德爾遺傳規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬13號染色體上CNVR的分類與長度分布

本課題組前期研究獲得了 SSC13上的 32個CNVR, 其中16個是重復(fù)區(qū)域, 10個為缺失區(qū)域, 6個同時存在重復(fù)和缺失的區(qū)域[5]。本研究計算結(jié)果表明：所有CNVR全長45 722 kb, 占該染色體總長的20.9%,平均每個CNVR長1428 kb, 最大的可達12 411 kb,最小的僅27.6 kb, CNVR的中值為250.1 kb。

2.2 豬13號染色體CNVR中的基因注釋及其功能分析

使用Ensembl中的Biomart工具檢索本課題組前期獲得的SSC13上32個CNVR內(nèi)的基因, 發(fā)現(xiàn)具有Ensembl ID的基因共236個, 其中注釋基因169個(占71.6%)。CNVR中, 基因的密度為5.16/Mb。

將上述 236個基因與人類基因進行同源比對,發(fā)現(xiàn)其中的 180個基因在人基因組中進行過注釋。GO分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與蛋白質(zhì)水解(Proteolysis)、細胞粘附(Cell adhesion)、大分子降解(Macromolecule catabolic process)等生物學過程, 并具有調(diào)節(jié)酶活性(Peptidase activity)、離子通道活性(Ion channel activity)的生物學作用(圖1)。

2.3 豬13號染色體上RCAN1基因的拷貝數(shù)檢測結(jié)果

經(jīng)過BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析, 參考基因組上無其他與RCAN1基因高度同源序列, 因此推斷該基因在每條染色體上各含有 1個拷貝。QPCR方法檢測結(jié)果顯示：該基因在10個個體中發(fā)生了拷貝數(shù)的增加, 在14個個體中發(fā)生了拷貝數(shù)的缺失(圖 2), 說明在不同萊蕪豬個體中, RCAN1基因存在拷貝數(shù)變異, 與SNP芯片檢測結(jié)果一致, 從而進一步驗證了CNVR內(nèi)拷貝數(shù)變異的真實存在。

2.4 候選基因 RCAN1拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律分析結(jié)果

分析樣本來自萊蕪豬A、B、C 3個家系15個個體。利用QPCR方法所檢測的3個家系親子兩代的 RCAN1基因的拷貝數(shù)及其拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律分析結(jié)果如圖3所示。

從圖3可看出：①A家系中父本含有1個拷貝,基因型為0/1, 母本含有3個拷貝, 基因型為 1/2, 3個子代個體分別有 1、3、2個拷貝, 基因型分別為0/1、1/2、1/1或 0/2; ②B、C家系為同一父本, 父本均有2個拷貝, 基因型均為0/2, 母本均有1個拷貝, 基因型均為0/1, 所有子代個體包含1、2、3 共3種拷貝數(shù)和0/1、0/2、1/2共3種基因型。③在同一個體的一條染色體上 RCAN1基因的拷貝數(shù)不同,有缺失(0個拷貝)也有重復(fù)(2個拷貝), 但是萊蕪豬個體中不存在缺失純合子(0/0)。

圖1 GO方法預(yù)測豬13號染色體上CNVR內(nèi)基因功能的結(jié)果1：蛋白質(zhì)水解; 2：細胞粘附; 3：生物粘附; 4：大分子降解; :5：離子轉(zhuǎn)運; 6：細胞外蛋白質(zhì)代謝; 7：細胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝; 8：蛋白質(zhì)分解; 9：陽離子運輸; 10：修飾依賴的大分子代謝; 11：修飾依賴的蛋白質(zhì)代謝; 12：細胞間粘附; 13：不依賴鈣的細胞間粘附; 14：肽酶活性; 15：作用于亮氨酸的肽酶活性; 16：細胞內(nèi)肽酶活性; 17：離子通道活性; 18：底物特異性通道活性; 19：通道活性; 20：堿金屬離子結(jié)合; 21：門控通道活性; 22：清道夫受體活性。

圖2 QPCR方法檢測萊蕪豬13號染色體上RCAN1基因拷貝數(shù)的結(jié)果相對于參考個體D4509, 有10個個體(604、993、1163、48、1268、2424、934、340、1647和1631)發(fā)生了拷貝數(shù)的增加, 有14個個體(3022、1721、307、1661、1653、1602、1680、1604、1596、209、163、1592、2715和538)發(fā)生了拷貝數(shù)的缺失。

3 討 論

3.1 豬13號染色體具有豐富的CNV及其在標記選擇中的可能作用

根據(jù)Ensembl(http://asia.ensembl.org/index.html)提供的信息, 豬13號染色體全長約218 635 kb, 所有CNVR長度45 721 kb, 約占13號染色體的20.9%。Li等[7]發(fā)現(xiàn)在豬的不同染色體中, CNVR所占的比例介于 0.14%～1.87%之間; 在綿羊的不同染色體上, CNV可以覆蓋0.46%～5.08%[8]; 牛的不同染色體中, CNVR約占 0.08%～3.5%[9]。然而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), SSC13上CNVR的比例遠遠高于在豬、綿羊、牛中已有的報道。另外, 本研究中豬 13號染色體上CNVR重復(fù)區(qū)域數(shù)(16個)要多于缺失區(qū)域數(shù)(10個),這與已有的報道中各染色體上缺失區(qū)域數(shù)多于重復(fù)區(qū)域數(shù)[10]的結(jié)果不一致。這說明本研究中SSC13上具有豐富的拷貝數(shù)變異。

圖3 RCAN1基因拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律分析結(jié)果

Ensembl數(shù)據(jù)庫中, 豬13號染色體全長含編碼基因1298個, 計算得出基因密度為5.95/Mb。Conrad等[11]和 Freeman等[12]在人類基因組的研究結(jié)果表明：CNV更多的趨向于發(fā)生在基因匱乏的區(qū)域。而本研究發(fā)現(xiàn)SSC13上CNVR內(nèi)的基因密度與該染色體上的基因密度差異不顯著, 這說明豬的13號染色體上CNV的分布比較均勻, 并不趨向于發(fā)生在基因匱乏或者基因富集的區(qū)域。

根據(jù)比較基因組學方法所得出的結(jié)果推斷, SSC13上CNVR中的180個基因其生物學功能可能涉及參與蛋白質(zhì)水解、細胞粘附過程, 可能影響機體能量代謝和免疫等生物學活動。課題組前期工作中發(fā)現(xiàn)萊蕪豬尤其特殊, 在13號染色體上存在大范圍的染色體缺失或重復(fù)區(qū)域, 而萊蕪豬具有肌內(nèi)脂肪含量高的種質(zhì)特性[13], 是目前所報道的肌內(nèi)脂肪含量最高的品種。CNV的存在是否與萊蕪豬的高肌內(nèi)脂肪含量有關(guān), CNVR內(nèi)的基因是否可作為萊蕪豬的候選基因值得進一步研究。

3.2 關(guān)于QPCR驗證結(jié)果及遺傳規(guī)律分析

根據(jù)RCAN1基因在3個萊蕪豬家系上下代中的拷貝數(shù), 假設(shè)該基因存在 2個及以上拷貝時, 呈現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)且完全連鎖, A家系中, 父本的基因型為0/1, 母本的基因型可能存在0/3或1/2兩種情況, 如果母本為0/3, 后代會有0/0、0/1、0/3、1/3等4種基因型和0、1、3、4共4種拷貝數(shù); 如果為1/2, 后代會有0/1、0/2、1/1、1/2這4種基因型和1、2、3等3種拷貝數(shù), 由于子代中出現(xiàn)了RCAN1基因拷貝數(shù)為2的個體, 所以母本的基因型只能是1/2。B、C家系中, 母本基因型均為 0/1, 父本基因型可能存在1/1或0/2兩種情況, 如果為1/1, 后代會有0/1、1/1兩種基因型和1、2兩種拷貝數(shù); 如果為0/2, 后代會有0/0、0/1、0/2、1/2這4種基因型和0、1、2、3共4種拷貝數(shù), 由于C家系子代中出現(xiàn)了RCAN1基因拷貝數(shù)為 3的個體, 那么父本的基因型只能為0/2。由此推斷該基因的拷貝數(shù)變異在萊蕪豬群體中符合孟德爾分離定律, 為CNV的遺傳規(guī)律研究提供了素材和研究基礎(chǔ)。

B、C家系中, 父本基因型為0/2, 母本基因型為0/1, 則可以產(chǎn)生0/0、0/1、0/2、1/2共4種基因型的后代, 但是本研究并沒有發(fā)現(xiàn)基因型為 0/0的子代個體, 可能是因為本研究的家系含量小, 不能使所有的基因型在后代都能出現(xiàn)。另一方面, RCAN1基因可以調(diào)節(jié)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin, CN)的活性, Park等[14]的研究表明RCAN1基因的表達與唐氏綜合征具有密切關(guān)系, Ermak等[15]也發(fā)現(xiàn)RCAN1基因在人腦中的高表達可以引起阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease, AD), 說明RCAN1基因在一些疾病中發(fā)揮了重要作用。本研究在萊蕪豬3個家系中未發(fā)現(xiàn)缺失純合體, 這可能是因為RCAN1基因具有重要功能, 缺失純合體生活力弱或者胚胎期已死亡。這種推斷尚有待進一步在群體中進行驗證或在細胞水平上進行研究。

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(責任編委: 李紹武)

Investigation of genes within copy number variation regions in pig chromosome 13 and analysis of the genetic law

Jing Liu, Yanan Wang, Yaqi Sun, Hongyang Wang, Chao Wang, Zhongzhen Peng, Bang Liu

Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Education, College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

Copy number variation (CNV), referring to a genome structure variation, has attracted researchers’ great interests. Thirty-two CNV regions (CNV region, CNVR) have been detected on chromosome 13 in our previous work. In order to detect the genes located in these CNVRs, we first obtained the annotated information from Ensembl database, and searched gene functional enrichments using DAVID online tools. In the 32 CNVRs, a total of 236 genes were identified, in which 169 genes were annotated. Gene Ontology (GO) analysis revealed that these genes mainly participate in proteolysis, cell adhesion, and macromolecular catabolic process. To study the genetic law of these CNVs, we chose the RCAN1 (regulators of calcineurin 1) gene as the candidate. We quantified the copy number of RCAN1 gene in 38 Laiwu pigs by usingQPCR method, and analyzed the genetic laws in three Laiwu families including 15 pigs. QPCR results showed that both duplication and deletion occurred in RCAN1 gene among Laiwu pigs and the heredity mode corresponds with Mendelian genetic law.

copy number variation; chromosome 13; RCAN1 gene; genetic law; Laiwu pigs

2013-10-14;

2013-12-30

國家自然科學基金項目(編號：31072012)和全國大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃創(chuàng)新訓練項目(編號：201210504001)資助

劉靜, 碩士研究生, 專業(yè)方向：動物功能基因組學。E-mail: liujing7791621@163.com

劉榜, 博士, 教授, 研究方向：動物分子生物學與育種。E-mail: liubang@mail.hzau.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0354

時間: 2014-2-13 14:24:20

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140213.1424.001.html