離體外翻腸囊法研究頭花蓼提取物中5個成分的腸吸收特性

唐 麗，劉 躍，黃 勇，廖尚高，蘭燕宇

（貴陽醫(yī)學(xué)院1.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心、2.藥學(xué)院貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州貴陽 550004）

頭花蓼（Polygonum capitatumBuch.-Ham.ex D.Don）屬于蓼科（Polygonaceae）、蓼屬（Polygonum）、頭狀蓼組（Cephalophilon）多年生草本植物，是貴州省別具特色的苗藥資源之一。目前，頭花蓼是貴州省中藥現(xiàn)代化重點培育發(fā)展的“十大苗藥”和“十大中藥產(chǎn)業(yè)鏈”品種之一，收載于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》［1］。具有清熱解毒、利尿通淋之效，臨床上主要用于泌尿系統(tǒng)感染等癥的治療。

腸外翻模型是由Wilson和Wiseman于1954年創(chuàng)建，最早用于研究葡萄糖和氨基酸在腸道的代謝與轉(zhuǎn)運［2］，后經(jīng)改進，目前成為最常用的體外腸道吸收生物模型，是一種能夠快速反映藥物吸收行為的體外方法。鑒于目前頭花蓼的藥效物質(zhì)不明確，故本實驗采用“簡便、快速、重復(fù)性良好”的大鼠腸囊外翻模型［3－4］，應(yīng)用 UPLC-MS/MS法考察頭花蓼提取物中沒食子酸、原兒茶酸，楊梅苷、陸地棉苷及槲皮苷5種主要成分在小腸中的吸收特性，為頭花蓼的藥效物質(zhì)提供實驗參考。

1 材料

1.1 儀器與試藥超高液相色譜－三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；Allegra 64R高速離心機（美國Beckman Coulter公司）；自制麥氏浴管；混合氣體（95%O2，5%CO2）；DK-98-ⅡA恒溫水裕鍋（天津泰斯特儀器有限公司）。

沒食子酸（批號M20－101209，中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心）；原兒茶酸（批號110306）、楊梅苷（批號111018），均購自四川省維克奇生物科技有限公司；槲皮苷、陸地棉苷（貴州省藥物制劑重點實驗室制備，純度≥98%）；葛根素（內(nèi)標，批號0752-9605，中國藥品生物制品鑒定所）；頭花蓼提取物（自制，批號20130407），乙腈、甲酸為色譜純；Tyrode緩沖液（NaCl8.0 g、KCl0.2 g、NaHCO31.0 g、NaH2PO40.05 g及MgCl20.1 g，加500ml蒸餾水溶解，0.2 g CaCl2溶于 500 ml蒸餾水，兩者混勻后加入1.0 g葡萄糖即可）。

1.2 試驗動物健康SD♂，體質(zhì)量為（220±20）g，由貴陽醫(yī)學(xué)院動物中心提供，批號：SCXK（黔）2002－0001。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）柱，流動相：0.1%甲酸乙腈（A）－0.1%甲酸水（B），梯度為0～1.5 min：5% ～35%（A），1.5～3min：35%～95%（A），3～4 min：95% ～5%（A）；流速 0.35 ml·min－1；柱溫 45℃，進樣體積 1μl。

2.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子化（ESI），毛細管電離電壓：3 kV，離子源溫度120℃ ；噴霧氣與反吹氣：N2，去溶劑氣流速：650 L/hr，去溶劑氣溫度：350℃，反吹氣流速為 50 L/hr；掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM），沒食子酸：m/z（－）169→125、原兒茶酸：m/z（－）152.9→109、楊梅苷：m/z（＋）465.3→319、陸地棉苷：m/z（＋）465.2→303、槲皮苷：m/z（＋）449.2→303.1及葛根素：m/z（＋）417→267。

2.3 供試藥液制備取頭花蓼藥材（購自貴州施秉頭花蓼GAP種植基地）1 000 g，加水煎煮2次，每次1.5 h，煎液濾過，合并濾液，濃縮干燥后得頭花蓼提取物。沒食子酸、原兒茶酸、楊梅苷、陸地棉苷及槲皮苷在提取物中的百分含量分別為：1.445%、0.042%、0.025%、0.055%、0.208%。稱取頭花蓼提取物適量溶解于Tyrode液中，10 000 r·min－1離心5min，配制成低、中、高濃度分別為 18.73、37.45、74.90 g·L－1的頭花蓼提取物腸吸收液。

2.4 外翻腸囊實驗同參考文獻［5］，本實驗根據(jù)其進行適當修改，將制備的腸管放入盛有10 ml 37℃恒溫Tyrode液的麥氏浴管中，開始供混合氣體（95%O2，5%CO2）。在腸管中注入2mlTyrode液平衡10min，將Tyrode液換成低、中、高3個濃度的含藥 Tyrode液，分別在 15、20、45、60、90、120 min取樣200μl，同時補充等體積的37℃Tyrode液。樣品放入Eppendorf管中，－20℃保存。實驗后將各腸管縱向剖開，自然攤于濾紙上測量其長度和寬度，記錄吸收面積A。取腸外翻樣品溶液 100μl，加 10μl、20 mg·L－1內(nèi)標溶液 300μl 15%乙腈及50μl 1%的甲酸，渦混1 min，15 000 r·min－1離心5 min，取上清液進樣UPLC-MS分析。

Tab 1 The K a of five ingredients of Polygonum capitatum in different concentrations at duodenum and jejunum（±s，n＝3）

Tab 1 The K a of five ingredients of Polygonum capitatum in different concentrations at duodenum and jejunum（±s，n＝3）

*P＜0．05 vs high concentration；＃P＜0．05 vs middle concentration

Group Duodenum High concentration Middle concentration Low Low concentration Gallic acid 0.618±0.845 0.438±0.043* 0.229±0.022* 0.845±0.103 0.672±0.090*0.297±0.070*＃concentration Jejunum High concentration Middle concentration Protocatechuic acid 0.479±0.117 0.430±0.061 0.184±0.010*＃ 0.635±0.139 0.552±0.067*0.239±0.032*＃Quercitrin 0.356±0.015 0.339±0.112* 0.182±0.058*＃ 0.576±0.248 0.451±0.102 0.186±0.074*＃Hirsutrin 0.282±0.030 0.271±0.099* 0.231±0.163*＃ 0.388±0.080 0.316±0.172*0.210±0.038*Myricitrin 0.045±0.011 0.034±0.008 0.007±0.002*＃ 0.055±0.016 0.044±0.003 0.008±0.003*＃

Tab 2 The K a of five ingredients of Polygonum capitatum in different concentrations at ileum and colon（±s，n＝3）

Tab 2 The K a of five ingredients of Polygonum capitatum in different concentrations at ileum and colon（±s，n＝3）

*P＜0．05 vs high concentration；＃P＜0．05 vs middle concentration

Group Ileum High concentration Middle concentration Low Low concentration Gallic acid 0.706±0.126 0.616±0.039* 0.291±0.072*＃ 0.527±0.131 0.412±0.061 0.175±0.071*＃concentration Colon High concentration Middle concentration Protocatechuic acid 0.580±0.072 0.576±0.054 0.250±0.035*＃ 0.412±0.057 0.301±0.073 0.135±0.046*＃Quercitrin 0.542±0.051 0.377±0.074* 0.200±0.116*＃ 0.259±0.022 0.172±0.043*0.106±0.050*＃Hirsutrin 0.445±0.016 0.346±0.047* 0.230±0.147*＃ 0.217±0.036 0.179±0.088*0.089±0.028*＃Myricitrin 0.056±0.008 0.048±0.025 0.008±0.005*＃ 0.032±0.007 0.018±0.004*0.004±0.002*＃

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理同參考文獻［6］。

3 結(jié)果

3．1 不同腸段中5個成分的單位腸管面積累計吸收量（Q）比較比較5個成分在不同腸段的單位腸管面積累積吸收量（Q），在120 min時，空腸對沒食子酸、原兒茶酸及槲皮苷的累積吸收量最高，其次為回腸、十二指腸與結(jié)腸。5個成分中沒食子酸、原兒茶酸與槲皮苷的累積吸收量較大，楊梅苷累計吸收量最小，5個成分在各腸道的吸收趨勢為空腸、回腸＞十二指腸＞結(jié)腸。

3．2 不同濃度頭花蓼提取物中5個成分在不同腸段中的K a比較對頭花蓼提取物不同濃度時沒食子酸等5個成分的吸收速率常數(shù)（Ka）進行方差分析比較，結(jié)果顯示，在各腸段中沒食子酸等5個成分的Ka隨著頭花蓼提取物濃度增加而增加（P＜0.05），表明沒食子酸、原兒茶酸、楊梅苷、陸地棉苷及槲皮苷的吸收可能為被動吸收，見Tab 1、2。

4 討論

本實驗結(jié)果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、槲皮苷、陸地棉苷及楊梅苷在小腸均有吸收，5個成分在各腸道的吸收趨勢為空腸、回腸＞十二指腸＞結(jié)腸，5個成分在相同腸段中的吸收差異較大，且同一個成分在不同部位和在相同部位不同濃度的吸收也存在差異，說明小腸對中藥成分具有選擇性吸收，而并不是簡單的半透膜被動吸收過程。且對5個成分的Ka及Q進行比較，發(fā)現(xiàn)這5個成分均具有濃度依賴，即5個化合物的Ka均隨著頭花蓼提取物藥液濃度的增加而增加（P＜0.05），符合被動吸收。但是通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)5個成分的濃度依賴卻有強有弱，因此，推測其中有的成分除了被動擴散還有其他的轉(zhuǎn)運方式，有待下一步實驗對其進行考察。

參考文獻：

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［1］Food and drug administration of Guizhou province DB52/YC001～420-2003.The quality standard of medicinal herbs，traditional medicines of Guizhou province［S］.The editorial committee of the quality standard of medicinal herbs、traditional medicines of Guizhou province.Guizhou：Guizhou Science and Technology Press，2003：147.

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