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    TLR4介導(dǎo)克羅恩病不同病變部位淋巴歸巢水平的差別

    2018-12-26 08:56:30
    關(guān)鍵詞:腸段歸巢淋巴細(xì)胞

    克羅恩病(Crohn's disease,CD)是一種腸道的持續(xù)性慢性炎癥疾病,其發(fā)病機(jī)制至今未明[1],且病變呈跳躍性分布,病變腸段之間可存在正常腸段,病變腸段與正常腸段的分布尚無(wú)明顯規(guī)律可循。是何種機(jī)制造成了CD發(fā)病部位差異性如此巨大的特點(diǎn)?大量研究表明CD的病變部位分布可能與淋巴細(xì)胞歸巢有關(guān),歸巢受體的表達(dá)差別可能決定了病變腸段的分布。那么淋巴細(xì)胞歸巢又受何種上游炎癥途徑調(diào)控與介導(dǎo)?這一現(xiàn)象值得深入研究。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 對(duì)象 選取廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院于2014年1月—2017年12月經(jīng)腸鏡及病理確診為CD的22例患者作為研究對(duì)象,年齡為18~39歲,平均年齡(27.0±4.2)歲;其中,男性12例,女性10例。另設(shè)10名行腸鏡示正常的健康人作為空白對(duì)照。

    1.1.2 材料和儀器 CCR9、TLR4引物來(lái)源于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。9700PCR儀來(lái)源于美國(guó)ABI公司。兔抗人CCR9、TLR4及羊抗兔二抗來(lái)源于美國(guó)SantCruz公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 標(biāo)本的采集 22例患者于腸鏡下分別在病變腸段及正常腸段取得黏膜組織,10名健康人亦于腸鏡下取組織標(biāo)本。

    1.2.2 RT-PCR檢測(cè)CCR9、TLR4在核酸水平的表達(dá) 提取結(jié)腸組織RNA后RT-PCR檢測(cè)CCR9、TLR4的表達(dá),95℃ 3 min,95℃40 sec;54 ℃ 50 sec(β-actin),59 ℃ 50 sec(CCR9、TLR4);72℃ 50 sec共30循環(huán);72℃ 10 min。聚丙烯酰胺凝膠電泳,計(jì)算積分光密度。

    1.2.3 Western blotting檢測(cè)CCR9、TLR4在蛋白水平的表達(dá) 結(jié)腸標(biāo)本蛋白提取后上樣于凝膠,于86 V下電泳80 min,轉(zhuǎn)膜1 hr,封閉1 hr。分別加入一抗1 hr。洗去一抗;封閉液處理。加入對(duì)應(yīng)二抗1 hr。洗去二抗。顯色4 min,顯影1 min,定影5 min。計(jì)算條帶的積分密度。

    1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,計(jì)量資料以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以(n,%)表示,采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Pearson分析法分析各計(jì)量資料之間的相關(guān)性。

    2 結(jié)果

    2.1 RT-PCR檢測(cè)CCR9、TLR4在CD患者腸道不同病變部位的表達(dá)

    CD患者病變腸段組CCR9、TLR4的表達(dá)高于CD患者正常腸段組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),CD患者正常腸段組、CD患者病變腸段組均高于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常人結(jié)腸內(nèi)未觀察到CCR9、TLR4表達(dá)。見圖1,表1。

    圖1 RT-PCR檢測(cè)CCR9、TLR4的表達(dá)

    表1 RT-PCR檢測(cè)各組樣本CCR9、TLR4的表達(dá)(±s)

    表1 RT-PCR檢測(cè)各組樣本CCR9、TLR4的表達(dá)(±s)

    注:與正常組比較,*P<0.05;與CD患者正常腸段組比較,#P<0.05

    正常組(n=10) 0 0 CD患者正常腸段組(n=22) 0.54±0.18* 0.11±0.02*CD患者病變腸段組(n=22) 0.85±0.23*# 0.32±0.07*#

    2.2 Western blotting檢測(cè)CCR9、TLR4在CD患者腸道不同病變部位的表達(dá)

    CD患者病變腸段組織中CCR9、TLR4的表達(dá)高于CD患者正常腸段,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),CD患者正常腸段組、CD患者病變腸段組均高于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常人結(jié)腸內(nèi)未觀察到CCR9、TLR4表達(dá)。見圖2,表2。

    圖2 Western blotting檢測(cè)CCR9、TLR4的表達(dá)

    表2 Western blotting檢測(cè)各組樣本CCR9、TLR4的表達(dá)(±s)

    表2 Western blotting檢測(cè)各組樣本CCR9、TLR4的表達(dá)(±s)

    注:與正常組比較,*P<0.05;與CD患者正常腸段組比較,#P<0.05

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    2.3 CCR9與TLR4表達(dá)水平的相關(guān)性

    CCR9與TLR4在核酸表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)(r=0.842,P<0.05)。CCR9與TLR4在蛋白表達(dá)水平上亦呈明顯正相關(guān)(r=0.791,P<0.05)。

    3 討論

    CD的發(fā)病機(jī)制一直是當(dāng)前胃腸道疾病的研究熱點(diǎn)之一。有學(xué)者提出了淋巴細(xì)胞歸巢(lymphocyte homing,LH)可能作為CD發(fā)病的始動(dòng)因素[2]。國(guó)內(nèi)外已有動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)在IBD的動(dòng)物模型中,可觀察到LH的活化水平升高。類似的研究都表明,LH水平的升高是腸道細(xì)胞免疫的炎癥反應(yīng)中重要的一環(huán),其與IBD的發(fā)病密切相關(guān)[3-4]。

    本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在CD患者病變部位,趨化因子受體9(chemokine receptor 9,CCR9)的表達(dá)明顯升高,CCR9是淋巴細(xì)胞歸巢重要的受體之一,其升高說明局部淋巴細(xì)胞歸巢的活化,而CCR9的升高程度與病變部位的炎癥反應(yīng)呈正比,說明淋巴細(xì)胞歸巢介導(dǎo)了下游炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生,其表達(dá)的升高與發(fā)病部位相關(guān)[5-8]。這與已有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果是相一致的。雖然淋巴細(xì)胞歸巢參與了CD的發(fā)病機(jī)理,但什么原因?qū)е铝薈D局部病變部位炎癥的起始及放大,使得相對(duì)整個(gè)腸道來(lái)說,只有局部特定部位才會(huì)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞歸巢水平的升高?本研究發(fā)現(xiàn),淋巴細(xì)胞歸巢的受體CCR9與Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)密切相關(guān),在CD患者的病變部位,不僅可觀察到TLR4的明顯升高,而且CCR9也與其保持一致;CD患者腸道的正常部位仍有TLR4的升高,且CCR9亦與其保持一致,這一現(xiàn)象值得進(jìn)一步探討。已有相當(dāng)多的研究表明,CD的發(fā)病與TLR4密切相關(guān)[9-10]。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果,我們推測(cè),TLR4不但參與了CD的發(fā)病,而且其介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞歸巢也是形成CD病變處于腸道不同部位的重要原因。Toll樣受體率先對(duì)原本耐受的微生物或其成分形成應(yīng)答而不再耐受,Toll樣受體活化后即通過其跨膜傳遞信號(hào)的特點(diǎn)相繼激活下游炎癥因子,將免疫失衡的信號(hào)放大傳遞給細(xì)胞及體液免疫系統(tǒng),由此最終導(dǎo)致淋巴細(xì)胞歸巢的水平變化,不僅如此,腸道不同部位的免疫穩(wěn)態(tài)并不一定一致,在免疫嚴(yán)重失衡的部位,調(diào)控淋巴細(xì)胞歸巢水平的免疫因素也更加活躍,這一系列反應(yīng)最終導(dǎo)致歸巢的淋巴細(xì)胞大量游出并粘附至相關(guān)病變部位,最終導(dǎo)致了病變的發(fā)生[11-14],這即可能成為CD的發(fā)病機(jī)制。

    綜上所述,本試驗(yàn)認(rèn)為引起CD病變部位不同的機(jī)制可能與CCR9、TLR4介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞歸巢有關(guān),其具體機(jī)制為Toll樣受體介導(dǎo)的免疫失衡引起了病變部位淋巴細(xì)胞歸巢的活化。

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