一種光化學(xué)損傷誘導(dǎo)的三叉神經(jīng)痛大鼠模型的建立

崔 悅，趙 佳，王 曄，孫丹丹，張 瑩，劉 洋，趙小亮，牛曉紅，張美玉，王丹巧，高天樂，徐曉軍

（1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林長春 130021；2.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700；3.卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院，斯德哥爾摩瑞典 14186）

三叉神經(jīng)痛（trigeminal neuralgia，TN）是指在三叉神經(jīng)分布區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)的反復(fù)發(fā)作、短暫、劇烈的疼痛［1］。因其不斷增長的發(fā)病率和缺乏有效的治療方法，成為臨床治療的難題。由于TN的病因復(fù)雜，發(fā)病機制尚不明確，臨床前動物實驗與臨床實際情況差距較大，需進一步研究和探索，因此，建立與臨床癥狀、病理、生化機制及藥物反應(yīng)吻合性較好的動物模型至關(guān)重要。近年來，國內(nèi)外常用三叉神經(jīng)末梢、神經(jīng)干、神經(jīng)根、神經(jīng)節(jié)、神經(jīng)核等慢性損傷的方法制造TN動物模型，其中慢性縮窄環(huán)模型［2］因較好地模擬了TN血管壓迫學(xué)說，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)性研究。

本實驗參考瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院 Hao等［3］和Dominguez等［4］的方法，采用赤蘚紅 B靜脈注射加激光照射，以模擬三叉神經(jīng)微循環(huán)障礙、神經(jīng)纖維脫髓鞘的病理機制，制作光化學(xué)損傷誘導(dǎo)的TN（photochemically-induced trigeminal neuralgia，PITN）大鼠模型。觀察其神經(jīng)支配顏面部位的機械痛閾變化，檢測其外周神經(jīng)系統(tǒng)三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)Tac1mRNA表達(dá)量及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦紋狀體細(xì)胞外液中Glu濃度（前者為編碼致痛的P物質(zhì)前體的基因［5－7］，后者為興奮性氨基酸、重要的疼痛相關(guān)遞質(zhì)［8］），并觀察臨床常用鎮(zhèn)痛藥物加巴噴丁對其的影響，為PITN大鼠模型的建立及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供SD大鼠，♂，體質(zhì)量180－250 g，動物許可證編號為SCXK（京）2006－0009。

1.2 藥品、試劑與儀器Glu、乙酸鈉、Erythrosin B（赤蘚紅B）、硼酸、庚烷硫酸鈉購于Sigma公司。鄰苯二甲醛（OPA）購于Aldrich公司。甲醇購于 Fisher Chemicals公司。EDTA、KH2PO4為北京化工廠生產(chǎn)。加巴噴丁膠囊（gabapentin capsules）購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號為12031291No.107。SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購于日本TaKaRa公司，RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒及引物均由北京曠博生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

大鼠腦立體定位儀、顱鉆購于深圳瑞沃德公司。51000-20C Von Frey hairs疼痛測試包購于美國Danmic公司。氬離子激光器系統(tǒng)的主要部分D-35037 SA11118972氬離子激光發(fā)生器為德國Sacher Lasertechnik集團生產(chǎn)。微透析系統(tǒng)由美國Instech公司出品的五通轉(zhuǎn)環(huán)清醒活動裝置、瑞典CMA公司生產(chǎn)的透析膜長度為4 mm的 CMA/12探針及套管、CMA/470低溫樣品自動收集器、CMA/402微量泵組成。高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)由Aglient1200、G1321A化學(xué)工作站、熒光檢測器組成。熒光定量PCR設(shè)備7900HT購于美國ABI公司。

1．3 PITN大鼠模型的建立、實驗分組及行為學(xué)測評大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，用Von Frey hairs對其三叉神經(jīng)支配的面部觸須墊進行每日連續(xù)5次的刺激，直到大鼠對以上刺激反應(yīng)平靜。篩選出連續(xù)3 d痛閾值≥26 g的動物57只，隨機分為假手術(shù)對照組（n＝6）和 TN手術(shù)組（n＝51）。腹腔注射10%水合氯醛（350 mg·kg－1）麻醉，手術(shù)組在動物觸須墊上方眶下孔位置橫向剪開長度約1 cm的切口，鈍性分離局部肌肉，暴露出深部的眶下神經(jīng)（三叉神經(jīng)上頜支的終支），將神經(jīng)束挑出，并于右側(cè)頸靜脈插入導(dǎo)管，注入赤蘚紅B 0.3 m l（32.5 mg·kg－1，溶解于 0.9%的生理鹽水），立即將大鼠置于功率344 mW，波長458－514 nm的氬離子激光器下，使光斑準(zhǔn)確照射暴露的眶下神經(jīng)13 min（由于赤蘚紅B在體內(nèi)的半衰期短，需每5 min經(jīng)靜脈補充注射0.4 m l，直至照射結(jié)束）?？p合顏面部及頸部傷口，常規(guī)注射慶大霉素預(yù)防感染。假手術(shù)對照組大鼠暴露、剝離眶下神經(jīng)后即縫合。術(shù)后d 7開始用質(zhì)量單位由小至大的Von Frey hairs對動物術(shù)側(cè)觸須墊部位進行刺激，評價方法參照1999年Juhana等［9］的標(biāo)準(zhǔn)，將大鼠安置于鼠籠中，待其適應(yīng)周圍環(huán)境后對其進行測評，連續(xù)刺激5次，每次時間間隔≥1 s，將連續(xù)測評5次中出現(xiàn)3次搔抓、躲避、攻擊行為中的一項或一項以上陽性反應(yīng)的最小值視為三叉神經(jīng)支配的顏面區(qū)域機械痛閾值。連續(xù)3 d測得痛閾值≤4 g的動物視為造模成功。術(shù)后d 10，隨機抽取模型動物12只，分為模型組（與假手術(shù)對照組相同，投與等量生理鹽水）和加巴噴丁組（100 mg·kg－1），每組6只，記錄投藥前（0 min）、投藥后30、60 min的機械痛閾值。另取成模大鼠10只，每3 d測量機械痛閾值，觀察至術(shù)后d 60。

1．4 三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)Tac1m RNA的檢測3組實驗動物于給藥1 h后，麻醉下，取出患側(cè)三叉神經(jīng)節(jié)并迅速放入液氮保存。

將上述組織復(fù)溫后按照QuantoBio RNA提取試劑盒要求進行Total RNA的提取，測量Total RNA的濃度及260/280，符合標(biāo)準(zhǔn)后用QuantoBio cDNA合成試劑盒進行cDNA的合 成。Tac1上 游 引 物 序 列 為 5′-GGGCATGGTCAGATCTCTCACAA-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-TTATTTTACCGCTCACTGCTCGC-3′，擴增片段長度為191，以 cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參，反應(yīng)體系：2×qPCR Mix 10μl，Primer-F（10 nmol·L－1）及 Primer-R（10 nmol·L－1）各 2μl，模板cDNA 10μg，以去離子水補足20μl體系。40循環(huán)反應(yīng)參數(shù)：95℃孵育5 min，95℃孵育15 s，58℃孵育45 s，反應(yīng)結(jié)束后，軟件自動分析熒光信號并將其轉(zhuǎn)換為各目的基因的起始拷貝數(shù)和Ct值，同時檢測內(nèi)參基因β-actin表達(dá)以控制樣本間mRNA質(zhì)量的變異。相對定量方法：根據(jù)擴增曲線設(shè)定循環(huán)閾值（cycle threshold，CT），以 ΔCT（目的基因CT值 －內(nèi)參基因CT值）比較各組間Tac1基因表達(dá)差異。ΔCT值與目的基因起始拷貝數(shù)呈負(fù)相關(guān)。

1．5 紋狀體細(xì)胞外液的取樣及G lu的檢測給藥測評結(jié)束后，大鼠在麻醉下，于右側(cè)紋狀體（A：＋0.2 mm，L：＋3.0 mm，V：－7.5 mm）埋植并固定微透析探針套管，次日在清醒狀態(tài)下插入微透析探針，并安置于清醒自由活動裝置中，進行活體腦內(nèi)微透析采樣。高效液相－柱前OPA衍生－熒光法檢測樣品中 Glu水平［10］。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理計量資料用±s表示，應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，兩樣本比較采用t檢驗；同一時間點多組間的比較采用多元方差分析。

2 結(jié)果

2．1 光化學(xué)誘導(dǎo)的TN模型大鼠的行為學(xué)改變與假手術(shù)對照組比較，模型組大鼠術(shù)后表現(xiàn)為迅速抓咬刺激物、后退、蜷縮身體靠向籠壁、連續(xù)搔抓受刺激部位。于術(shù)后d 7模型組51只大鼠均出現(xiàn)了不同程度的三叉神經(jīng)支配的顏面部機械閾值下降，持續(xù)3 d小于4 g的大鼠為32只，模型成功率為63%。成模大鼠手術(shù)后d 7、8、9連續(xù)3 d測量均值與術(shù)前對照，痛閾值由26降低為（1.60±1.74）g（P＜0.01，n＝32），假手術(shù)對照組由26 g降低為（25.39±1.06）g（n＝6），無明顯差異，見Fig 1。加巴噴丁投藥后30、60 min可以有效緩解疼痛，明顯提高機械痛域值，見Fig 2。另外用于模型穩(wěn)定性觀察的10只動物在術(shù)后d 7－60內(nèi)機械閾值穩(wěn)定在（0.71±1.24）g（n＝10）。未見疼痛恢復(fù)跡象，見 Fig 3。

Fig 1 Changes ofmechanicalwithdraw threshold of PITN rats（sham：n＝6；model：n＝32）

Fig 2 Effect of gabapentin on mechanicalwithdraw threshold of PITN rats（±s，n＝6）

Fig 3 Dynam icmonitoring ofmechanical withdraw threshold of PITN rats（sham：n＝8；model：n＝10）

2．2 TN模型大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中Tac1基因mRNA表達(dá)量的變化實時熒光定量PCR技術(shù)檢測三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)Tac1 mRNA表達(dá)量結(jié)果顯示：模型組與假手術(shù)對照組相比其表達(dá)量明顯上調(diào)（P＜0.05），加巴噴丁抑制了造模引起的表達(dá)量上調(diào)，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見Tab 1。

2．3 TN模型大鼠紋狀體細(xì)胞外液中G lu水平的變化與假手術(shù)對照組相比，模型組紋狀體細(xì)胞外液中與疼痛密切相關(guān)的興奮性氨基酸Glu的含量明顯升高（P＜0.05），加巴噴丁對升高的Glu濃度顯示了抑制作用，給藥后60 min腦內(nèi)Glu含量迅速降低（P＜0.05），見Tab 1。

Tab 1 Tac1 mRNA expression in trigem inal ganglia and the G lu concentration in the striatum of TN rats（±s，n＝6）

Tab 1 Tac1 mRNA expression in trigem inal ganglia and the G lu concentration in the striatum of TN rats（±s，n＝6）

*P＜0.05 vs sham；＃P＜0.05 vs model

Group Tac1 mRNA（ΔCT） Glu/μmol·L－1 Sham 2.78±0.58 3.02±5.68 Model 1.92±0.34* 56.28±55.99*Gabapentin 2.58±0.2＃ 17.01±22.84＃

3 討論

原發(fā)性TN的發(fā)病機制至今尚不明確，能夠被廣泛接受并形成共識的是三叉神經(jīng)脫髓鞘。髓鞘脫失的神經(jīng)纖維與鄰近無髓鞘神經(jīng)纖維之間發(fā)生“短路”，輕微的觸覺即可因“短路”將神經(jīng)沖動快速傳輸至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，中樞的傳出沖動也可經(jīng)“短路”轉(zhuǎn)變?yōu)閭魅肷窠?jīng)沖動，如此反復(fù)累積疊加可迅速達(dá)到閾值，爆發(fā)TN的痛覺過敏或痛覺超敏［11］。

引起脫髓鞘主要原因是三叉神經(jīng)感覺根在入腦橋區(qū)受到血管的壓迫及神經(jīng)內(nèi)微循環(huán)障礙、髓鞘營養(yǎng)代謝紊亂。有學(xué)者在電鏡下觀察到Schwann細(xì)胞水腫、變性壞死及線粒體空化/壞死/崩解的現(xiàn)象［12］，支持脫髓鞘由神經(jīng)纖維缺血、缺氧引起的觀點。關(guān)于微循環(huán)障礙致神經(jīng)纖維脫髓鞘的病理過程，多數(shù)認(rèn)為首先是慢性缺血，然后是血－神經(jīng)屏障改變，最后導(dǎo)致神經(jīng)脫髓鞘。在這一過程中，神經(jīng)內(nèi)的巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)以及P物質(zhì)（SP）、Glu、降鈣素基因相關(guān)肽、β-內(nèi)啡肽、血管活性腸多肽等神經(jīng)肽類物質(zhì)均有參與，并發(fā)揮著重要作用。

目前，國內(nèi)外常用的TN動物模型有慢性縮窄環(huán)模型［13］、三叉神經(jīng)根埋植模型［14］、牙髓灌注模型［15］、暴露三叉神經(jīng)節(jié)模型、暴露三叉神經(jīng)根模型［16］等；也有人將青霉素等注射至大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔［17］，或直接注射于大鼠三叉神經(jīng)脊束核［18］等，觀察動物的行為及丘腦、皮層的電生理指標(biāo)等變化。上述模型主要是在三叉神經(jīng)周圍或中樞施加刺激以模擬TN的部分病理機制和癥狀。但是手術(shù)方法復(fù)雜不易掌握、破壞腦組織過多引起共濟失調(diào)、或大量出血致死；或術(shù)后動物存活率不高、狀態(tài)不佳，影響行為學(xué)的觀察等是其存在的缺點。即使被廣泛應(yīng)用的慢性縮窄環(huán)模型也存在一定問題：神經(jīng)結(jié)扎的松緊程度沒有客觀定量，易隨操作者的力度而變化，導(dǎo)致個體間脫髓鞘病變程度的差異，且結(jié)扎所用鉻線可能帶來神經(jīng)毒性等，均會間接影響實驗的結(jié)果。

本實驗參考瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院的造模方法，采用定量的赤蘚紅B靜脈注射加一定波長和功率的激光照射方法誘發(fā)TN。上述學(xué)者的前期研究已經(jīng)證實：赤蘚紅B作為一種光敏劑，靜脈注射后迅速分布于全身毛細(xì)血管，因其代謝迅速，半衰期只有5 min，不易引起機體損傷，但在激光照射下則發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，其結(jié)果會導(dǎo)致照射局部血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫、損傷，引起血小板活化、聚集，同纖維蛋白一起形成血栓，局部組織發(fā)生微循環(huán)障礙、缺血性壞死，進而引起神經(jīng)纖維脫髓鞘的病理改變［19］。Kupers等［20］用光化學(xué)損傷誘發(fā)大鼠坐骨神經(jīng)微循環(huán)障礙，觀察到神經(jīng)纖維發(fā)生脫髓鞘改變。三叉神經(jīng)內(nèi)血供豐富，光化學(xué)損傷誘導(dǎo)了局部微循環(huán)障礙、髓鞘營養(yǎng)代謝紊亂、導(dǎo)致TN的基礎(chǔ)病變－神經(jīng)脫髓鞘病變，引起慢性神經(jīng)病理性疼痛癥狀。另有研究顯示，三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)有豐富的SP陽性神經(jīng)元，其中樞突達(dá)三叉神經(jīng)感覺核，脫髓鞘發(fā)生后，突觸前膜去極化，Ca2＋內(nèi)流，囊泡膜與突觸前膜融合釋放SP，經(jīng)突觸后膜NK1受體，介導(dǎo)疼痛信息的傳遞，并由此產(chǎn)生正反饋作用形成鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，結(jié)果使突觸前膜釋放更多的神經(jīng)肽及神經(jīng)遞質(zhì)，進一步增強其興奮性［21－22］。SP引起的異常沖動可快速誘發(fā)腦部中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性增強，釋放大量興奮性氨基酸Glu，與突觸后膜上的促離子型受體結(jié)合，增加對Na＋、K＋的通透性，繼而引起細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高、相關(guān)蛋白激酶激活、NO等傷害性信息傳遞介質(zhì)生成和c-fos基因表達(dá)等一系列級聯(lián)反應(yīng)［8］，進一步加快興奮性信息傳遞，產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛。本課題組的前期研究顯示：坐骨神經(jīng)部分損傷［23］和切口痛［24］模型大鼠隨著機械痛敏和冷痛敏的產(chǎn)生，其紋狀體細(xì)胞外液Glu、脊髓和腦脊液中SP含量明顯增加。上述研究均提示，SP、Glu參與了TN等神經(jīng)源性疼痛時痛覺過敏或痛覺超敏的產(chǎn)生和維持。

本實驗系統(tǒng)觀察了光化學(xué)損傷三叉神經(jīng)后，大鼠相應(yīng)部位7～60 d疼痛行為學(xué)的動態(tài)變化：其疼痛敏感程度與臨床TN符合，成模時間僅為1周，成功率可達(dá)63%，模型穩(wěn)定，在觀察的2個月內(nèi)未見恢復(fù)跡象，模型重復(fù)性較好、個體差異小、動物成活率在90%以上，且對臨床有效藥物加巴噴丁反應(yīng)敏感。由于該方法導(dǎo)致的神經(jīng)損傷和疼痛行為學(xué)改變的程度可隨光敏劑用量和激光照射時間調(diào)節(jié)，會更加靈活、方便使用。

該模型在病因、病理機制和發(fā)病過程上較好地模擬了TN微循環(huán)障礙和神經(jīng)纖維脫髓鞘改變，符合TN等神經(jīng)源性疼痛中相關(guān)調(diào)質(zhì)/遞質(zhì)的變化規(guī)律：外周神經(jīng)系統(tǒng)（三叉神經(jīng)節(jié)）內(nèi)編碼SP前體的基因Tac1mRNA表達(dá)量隨疼痛的產(chǎn)生和維持而上調(diào)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（腦紋狀體細(xì)胞外液）中重要的疼痛相關(guān)遞質(zhì)Glu濃度隨疼痛的產(chǎn)生和維持而升高。臨床有效鎮(zhèn)痛藥物加巴噴丁對該模型發(fā)揮了明顯的鎮(zhèn)痛作用，表明該模型與TN的臨床治療效果有較好的吻合性。盡管本模型也存在一定的缺點與限制：實驗所必需的氬激光發(fā)射器價格較昂貴、占用實驗室空間較大；多次靜脈注射及分離神經(jīng)而較少傷害周圍組織及血管，需要操作精準(zhǔn)、實驗技術(shù)熟練等，但可以說對于TN的基礎(chǔ)研究和藥物篩選是可選擇的較好模型。此外，該方法也為缺血性神經(jīng)纖維脫髓鞘引起的其它外周神經(jīng)性疾病（如缺血性視盤病、血栓閉塞性脈管炎、福爾克曼氏攣縮、脛前綜合征等）動物模型的制作提供了參考。

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