C1q/TNFα相關(guān)蛋白-2球狀功能區(qū)的表達(dá)、純化及活性分析

李洪波，胡 興，李 娜，吳東海

（1.懷化學(xué)院生命科學(xué)系，民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化 418008；2.中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東廣州 510530）

C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白（C1q and tumor necrosis factor related protein，CTRP）是一類與脂聯(lián)素在結(jié)構(gòu)和功能上極為類似的蛋白。這些蛋白與脂聯(lián)素非常相似，一般由4個不同結(jié)構(gòu)域組成：N-末端的信號肽、短的可變結(jié)構(gòu)域、膠原結(jié)構(gòu)域和1個與補(bǔ)體蛋白C1q同源的C-末端的球形結(jié)構(gòu)域，C-末端的球形區(qū)是其功能區(qū)［1］。在已發(fā)現(xiàn)的CTRPs中，CTRP2與脂聯(lián)素的功能最為相似，CTRP2能快速激活A(yù)MPK、ACC及p44/42 MAPK的磷酸化信號通路；CTRP2球狀結(jié)構(gòu)域（gCTRP2）具有增加肝臟糖原合成、促進(jìn)脂肪酸的氧化及胰島素增敏作用。CTRPs作用機(jī)制的研究主要是利用其球狀功能區(qū)蛋白［1－3］。重組全長hCTRP2蛋白已在大腸桿菌中和酵母中實現(xiàn)活性表達(dá)［4－5］，本研究將以大腸桿菌為宿主菌，制備重組hCTRP2的球狀功能區(qū)蛋白（gH2），并對其活性進(jìn)行分析。

1 材料

表達(dá)菌株 BL21-codonplus（DE3）、表達(dá)載體pET32a（＋）購自Invitrogen公司。鎳親和層析樹脂購自Qiagen公司，分子篩Sephadex G-75購自于GE公司，抗體均購自于CST公司。8周齡的C57BL/6♂小鼠由中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院實驗動物中心飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物的驗證設(shè)計上游引物PF（5′-3′）：5′-GCGGATCCGTGGCAGTGACCAAGAGCTA C-3′（GGATCC BamHI位 點）；下 游 引 物 PR（5′-3′）：5′-GCCTCGAGTCAGATTAGGAAGCCCGTAAA G-3′（CTCGAG XhoI位點）；PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因并構(gòu)建重組載體pET32/gH2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-codonplus（DE3）菌株。隨機(jī)挑取數(shù)個轉(zhuǎn)化子單菌落，接種至20ml含50 g·L－1Amp LB液體培養(yǎng)基的50 ml三角瓶中，37℃、250 r·min－1培養(yǎng)至 A600＝0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.2mmol·L－1，20℃誘導(dǎo)3 h，取菌液2 ml，離心得菌體，向菌體中加入含1%曲拉通X-100、3mmol·L－1PMSF的PBS溶液200μl，超聲破碎，離心取上清80 μl，向其中加入20μl5×SDS-PAGE上樣緩沖液，加熱變性，SDS-PAGE分析目標(biāo)蛋白的可溶性表達(dá)情況。

2.2 重組蛋白純化取種子菌液1 ml，接種至200 m l抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 r·min－1培養(yǎng)至 A600＝0.6～0.8，于20℃誘導(dǎo)5 h，離心取菌體。鎳親合純化參照精編分子生物學(xué)實驗指南和文獻(xiàn)進(jìn)行［5－6］。將鎳親合純化后的蛋白利用曲拉通X-114去除內(nèi)毒素并濃縮，Superdex G-75分子篩純化，具體步驟參照文獻(xiàn)進(jìn)行［7］。取不同咪唑濃度的蛋白洗脫液和經(jīng)分子篩純化收集的蛋白，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液、經(jīng)煮沸變性后，15%SDS-PAGE分析純化情況，利用已制備的hCTRP2C-端特異體對蛋白進(jìn)行Western blot驗證［8］。Trx（硫氧還蛋白）的表達(dá)與純化參照文獻(xiàn)進(jìn)行［4］。

2.3 重組蛋白活性分析C2C12于5%胎牛血清中培養(yǎng)至90%細(xì)胞密度，2%馬血清的DMEM培養(yǎng)基分化培養(yǎng)6 d，無血清饑餓12 h，加入終濃度為1 mg·L－1Trx-gH2蛋白溫育不同時間，RIPA裂解細(xì)胞，離心收集蛋白上清，12%SDSPAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜并利用相應(yīng)抗體對相應(yīng)信號通路蛋白進(jìn)行Western blot分析。

C57BL/6小鼠實驗操作嚴(yán)格按照動物委員會的相關(guān)規(guī)定開展。實驗小鼠在實驗前先測定其基礎(chǔ)血糖濃度；之后，按2μg·g－1體重腹腔注射15只經(jīng)12 h饑餓的8周齡♂小鼠，尾靜脈取血10μl，測定注射后0－5 h的血糖濃度；同時，設(shè)注射Trx的對照實驗小鼠15只（2μg·g－1體重）。

3 結(jié)果

3.1 載體構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物驗證pET32/gH2重組載體測序表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)前后的SDS-PAGE結(jié)果如Fig 1所示，可以看出，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組載體BL21轉(zhuǎn)化子（泳道6）在35 ku的位置沒有出現(xiàn)明顯的特異表達(dá)產(chǎn)物，而5株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組載體的BL21轉(zhuǎn)化子（泳道1－5）在35 ku有明顯的蛋白表達(dá)（箭頭所示），該蛋白的分子質(zhì)量大小與預(yù)期分子質(zhì)量相符。

Fig 1 SDS-PAGE identification of the expression of Trx-gH2

3.2 重組蛋白的純化SDS-PAGE分析結(jié)果表明，利用含40 mmol·L－1咪唑的漂洗緩沖液幾乎不能將目標(biāo)蛋白從鎳親合層析柱上洗下；當(dāng)咪唑為100 mmol·L－1時，目標(biāo)蛋白的純度最高；當(dāng)咪唑濃度為200和300 mmol·L－1時目標(biāo)蛋白被大量洗脫但有少量雜蛋白（Fig 2-A）。將100 mmol·L－1咪唑洗脫的蛋白樣品收集，曲拉通X-114除去內(nèi)毒素后透析、超濾濃縮，再利用Sephadex G-75分子篩對重組蛋白進(jìn)一步純化，分子篩純化蛋白的洗脫曲線如Fig 2-B所示。洗脫曲線第1個峰的1－5號蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果如Fig 2-C所示，該蛋白在SDS-PAGE結(jié)果中看不到明顯雜蛋白條帶。利用hCTRP2的C-端特異性抗體對該蛋白進(jìn)行了Western blot分析，結(jié)果如Fig 2-D所示，Western blot結(jié)果表明，蛋白洗脫曲線峰1的蛋白是Trx-gH2蛋白。

3.3 活性分析細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Western blot結(jié)果如Fig 3A所示，經(jīng)2 mg·L－1的Trx-gH2刺激5 min，可以檢測到磷酸化ACC較刺激前加強(qiáng)；刺激細(xì)胞10 min，ACC磷酸化程度有明顯增強(qiáng)；當(dāng)刺激細(xì)胞達(dá)30 min，ACC磷酸化的增加更為明顯。由于Trx不能激活A(yù)CC的磷酸化［4］，細(xì)胞刺激實驗表明，大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白Trx-gH2具有生物活性。降血糖活性測定結(jié)果表明：在注射前，兩組小鼠的血糖水平?jīng)]有明顯差異；在注射1 h后，注射Trx-gH2小鼠的血糖要明顯低于注射Trx的對照小鼠，在注射2 h后兩者之間存在明顯差異；在注射后的1～4 h內(nèi)，注射Trx-gH2的實驗組小鼠的血糖都要明顯低于注射Trx的對照組小鼠，但注射后5 h，兩實驗組小鼠的血糖差異消失（Fig 3B）。動物實驗結(jié)果證明，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的Trx-gH2蛋白具有降血糖活性。

4 討論

Fig 2 Purification and identification of fusion recombinant protein of Trx-gH2

Fig 3 Biological activity assays of purified fusion recombinant protein Trx-gH2

利用酵母表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對hCTRP2的全長蛋白進(jìn)行了表達(dá)，在酵母表達(dá)系統(tǒng)中，重組蛋白被酵母自身分泌的Yapsin蛋白酶降解，因而分泌的hCTRP2蛋白被立即切割成分子量大小不同的片段［4－5，9］；pET32為表達(dá)載體，實現(xiàn)了全長hCTRP2在大腸桿菌中的可溶性融合表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性。hCTRP2的球狀區(qū)是其功能區(qū)，目前在對CTRPs蛋白的功能和作用機(jī)制研究時主要利用其球狀功能區(qū)蛋白。Lee等［10］將hCTRP6與GST融合，也實現(xiàn)了hCTRP6球狀區(qū)的可溶表達(dá)，但其表達(dá)量很低［10］。雖然GST標(biāo)簽也可增加一些重組蛋白的可溶性表達(dá)，但對于CTRPs蛋白，GST標(biāo)簽不能有效地增加CTRPs蛋白的可溶性表達(dá)。本研究最后以N端融合有Trx-tag的pET-32a（＋）為表達(dá)載體，實現(xiàn)hCTRP2球狀區(qū)蛋白的高效可溶表達(dá)。與酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)的Trx-gH2沒有出現(xiàn)產(chǎn)物降解現(xiàn)象，說明CTRP2在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性要比酵母高。

在細(xì)胞刺激實驗時，Trx-gH2和酵母表達(dá)的hCTRP2一樣，有激活A(yù)CC磷酸化的作用，在重組蛋白刺激細(xì)胞5 min后都能檢測到磷酸化水平的增加［5］；在檢測動物水平的降血糖活性時，酵母表達(dá)的全長hCTRP2在注射小鼠1 h時的降血糖活性并不明顯［5］，而注射Trx-gH2蛋白在注射1 h后呈現(xiàn)出降血糖活性，說明Trx-gH2蛋白在動物水平上的活性出現(xiàn)得似乎更快一些；注射酵母表達(dá)的hCTRP2的降血糖活性可以維持至少7 h［5］，而注射Trx-gH2 5 h后，其降血糖活性消失。由于Trx-gH2蛋白融合了Trx片段，雖然注射的蛋白質(zhì)量相同，但與酵母表達(dá)的hCTRP2相比，Trx-gH2蛋白質(zhì)分子要少，因此出現(xiàn)Trx-gH2降血糖持續(xù)活性不如酵母表達(dá)的全長hCTRP2?？傊?，本研究為hCTRP2或相似蛋白的可溶、穩(wěn)定和活性表達(dá)找到了一種高效的蛋白表達(dá)系統(tǒng)和純化方法。

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