理氣消癭片高效液相色譜指紋圖譜研究*

胡俊杰,肖伊,王桂紅,鄭國華

(1.湖北中醫(yī)藥大學藥學院,武漢 430065;2.湖北省孝感市食品藥品監(jiān)督管理局孝南區(qū)分局,孝感 432000)

理氣消癭片高效液相色譜指紋圖譜研究*

胡俊杰1,肖伊2,王桂紅1,鄭國華1

(1.湖北中醫(yī)藥大學藥學院,武漢 430065;2.湖北省孝感市食品藥品監(jiān)督管理局孝南區(qū)分局,孝感 432000)

目的 建立理氣消癭片的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜,為其質量控制提供依據(jù)。方法色譜柱Aichrom Bond-AQ C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相乙腈-0.1%磷酸溶液(梯度洗脫),柱溫30℃,流速1.0 mL·min-1,進樣量20 μL,檢測波長226 nm。結果建立了理氣消癭片的HPLC指紋圖譜,共標定了13個共有峰,確認了其中4個共有峰,10批理氣消癭片指紋圖譜的相似度均＞0.95。結論該方法準確、可靠,可以較全面、完整地反映理氣消癭片的質量。

理氣消癭片;圖譜,指紋;色譜法,高效液相

理氣消癭片是根據(jù)湖北省中醫(yī)院國家名老中醫(yī)陳如泉教授的經(jīng)驗方研制而成的中藥復方制劑,由青皮、白芥子、土貝母、柴胡等9味疏肝解郁、調理氣機中藥組成,具有疏肝理氣、化痰消癭之功效,主要用于痰氣交阻型癭病,臨床療效顯著。該方中中藥主要含有橙皮苷、芥子堿硫氰酸鹽、土貝母苷甲、柴胡皂苷等[1-4]多種化學成分。目前,單對一種成分進行質量控制已經(jīng)達不到有效控制和評價中藥復方制劑的目的。指紋圖譜能較全面地反映出組方中的成分[5],因此本實驗應用高效液相色譜法(HPLC)對理氣消癭片進行指紋圖譜的研究,建立理氣消癭片指紋圖譜的共有模式,以實現(xiàn)多成分評價理氣消癭片及其成方制劑的質量的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100型高效液相色譜儀(四元泵、紫外檢測器及配套色譜工作站);Mettler-Toledo AG285型分析天平(Mettler-ToledoGmbH,Laboratory& Weighing Technologies,Switzerland);DZHW型調溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);KH-400-FDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 橙皮苷對照品(批號:110712-200512)、柴胡皂苷a對照品(批號:110777-200404)、芥子堿硫氰酸鹽對照品(批號:111702-200501)、土貝母苷甲對照品(批號:111536-200304)均購自中國食品藥品檢定研究院,乙腈、磷酸為分析純,水為自制雙蒸水,10批理氣消癭片由湖北中醫(yī)藥大學制劑實驗室提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱Aichrom Bond-AQ C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),按表1的條件進行梯度洗脫;柱溫:30℃;流速:1.0 mL·min-1;進樣量:20 μL;檢測波長: 226 nm[6-7]。

2.2 供試品溶液的制備 取理氣消癭片10片,除去包衣,研細,取0.5 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,加60%甲醇40 mL,回流提取60 min,濾過,定容于50 mL量瓶中,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of mobile phase

2.3 對照品溶液的制備 分別取橙皮苷、芥子堿硫氰酸鹽、土貝母苷甲、柴胡皂苷a對照品適量,置10 mL量瓶中,加入適量甲醇,超聲溶解,定容,搖勻,濾過,即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度實驗 取理氣消癭片粉末0.5 g,精密稱定,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)重復進樣6次,記錄指紋圖譜并分析。結果,各共有峰相對保留時間的RSD為0.06%～0.67%,相對峰面積的RSD為0.25%～1.84%,RSD均＜3%。表明本方法精密度良好。

2.4.2 重復性實驗 取理氣消癭片粉末0.5 g,精密稱定,共6份,分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣,記錄指紋圖譜并分析。結果,供試品中各共有峰相對保留時間的RSD為0.14%～0.83%,相對峰面積的RSD為0.65%～1.64%,RSD均＜3%。表明本方法重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實驗 取理氣消癭片粉末0.5 g,精密稱定,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,分別于0,2, 4,8,24 h按“2.1”項下色譜條件進樣,記錄指紋圖譜并分析。結果,供試品中各共有峰相對保留時間的RSD為0.12%～0.73%,相對峰面積的RSD為0.33%～2.55%,RSD均＜3%。表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.5 理氣消癭片指紋圖譜的建立及其技術參數(shù)

2.5.1 理氣消癭片HPLC指紋圖譜建立 取理氣消癭片粉末,分別按“2.2”項方法制備供試品溶液,按“2.1”項色譜條件進樣,記錄指紋圖譜并分析,獲得理氣消癭片的HPLC指紋圖譜。見圖1。

2.5.2 共有指紋峰的標定 采用國家藥典委員會頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(版本: 2004 A)進行分析[8],根據(jù)相關要求[9],確定共有峰和指紋峰。以相對保留時間標定其共有峰13個,以第4號峰為參照峰S,測定各共有峰相對保留時間,結果表明RSD＜3.0%。見表2。

2.5.3 共有峰的歸屬 分別吸取芥子堿硫氰酸鹽、橙皮苷、土貝母苷甲、柴胡皂苷a對照品溶液,進樣20 μL,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,對比其保留時間和相應時間位置的色譜峰,確定指紋圖譜中的4號峰為芥子堿硫氰酸鹽,7號峰為橙皮苷,10號峰為土貝母苷甲,12號峰為柴胡皂苷a。

圖1 理氣消癭片的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of liqi xiaoying tablets

2.5.4 相似度計算 采用國家藥典委員會頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(版本:2004 A)[8]對10批樣品進行相似度分析。以S為參照得出對照指紋圖譜,以此為基礎進行整體相似度評價。結果10批樣品相似度依次為0.957,0.981,0.958, 0.969,0.980,0.953,0.982,0.956,0.956,0.953,均＞0.95,表明10批樣品中的化學成分較一致。

表2 10批樣品共有峰的相對保留時間Tab.2 Relative retention time of common peaks from ten batches of samples min

3 討論

3.1 流動相的選擇 本實驗考察了甲醇-水,甲醇-不同濃度的磷酸水,乙腈-水,乙腈-不同濃度的磷酸溶液洗脫系統(tǒng),其中乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)出峰數(shù)目較多,峰形和分離也比較理想。在此基礎上,調整乙腈與0.1%磷酸梯度洗脫比例關系,最終確定本實驗的色譜洗脫條件。

3.2 檢測波長的選擇 取一定濃度的供試品溶液,在波長200～700 nm范圍內進行全波長掃描,同時分別比較樣品在檢測波長226,254,280,365 nm處指紋圖譜的峰數(shù)目多少與分離度情況。結果表明在檢測波長226 nm時,色譜峰較多,分離度好,且部分藥材中已知主要化學成分都有顯示,故選擇檢測波長226 nm。

中藥是一個由多組分、多因素構成的復雜體系,其化學成分的多樣性與復雜性是其療效的物質基礎[10]。本研究建立了理氣消癭片HPLC指紋圖譜,所得到的色譜圖相似度＞0.95,符合要求;標定了共有特征(指紋)峰13個,并通過對照實驗,確定指紋圖譜中的4號峰為芥子堿硫氰酸鹽,7號峰為橙皮苷,10號峰為土貝母苷甲,12號峰為柴胡皂苷a。本研究中所建立的方法有較好的重復性、精密度和穩(wěn)定性,可以完整、全面地反映理氣消癭片的質量,為理氣消癭片的質量控制提供科學依據(jù)。

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.024

High Performance Liquid Chromatograph Fingerprint of Liqi Xiaoying Tablets

HU Jun-jie1,XIAO Yi2,WANG Gui-hong1,ZHENG Guo-hua1
(1.College of Pharmacy,Hubei College of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China;2.XiaonanDistrict Bureauof XiaoganFoodandDrug Administration,Xiaogan 432000,China)

Objective To establish high performance liquid chromatograph(HPLC)fingerprint ofliqi xiaoyingtablets,and to provide reference for quality control of the herbal medication.MethodsThe chromatography conditions consisted of Aichrom Bond-AQ C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)column with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid (gradient elution),column temperature of 30℃,flow rate of 1 mL·min-1,injection volume of 20 μL,and UV detection wavelength of 226 nm.ResultsHPLC fingerprint was established with 13 common peaks,4 of which were identified.The similarity of the HPLC fingerprints ofliqi xiaoyingtablets from 10 batches was greater than 0.95.ConclusionThe method is accurate,reliable,and can reflect complete information for the quality ofliqi xiaoyingtablets.

Liqi xiaoyingtablets;Chromatography,fingerprint;Chromatograph,high performance liquid

R286;R927.2

A

1004-0781(2014)08-1067-04

2013-10-07

2014-01-06

*武漢市科技攻關計劃(200860423218)

胡俊杰(1984-),男,湖北孝感人,實驗員,碩士,從事中藥新制劑、新劑型的研究。電話:(0)13407126284, E-mail:Hero0712@163.com。

鄭國華(1964-),男,天津人,教授,博士,從事中藥新制劑、新劑型的研究。電話:(0)13627108243,E-mail: zgh1227@sina.com。