復(fù)方鹿角霜對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型小鼠抗炎作用研究*

陳臘霞,王燕燕,孫偉光,許鑫

(1.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,宜昌 443002;2.湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院藥劑科,宜昌 443002;3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,武漢 430030;4.湖北中醫(yī)藥大學(xué),武漢 430065)

復(fù)方鹿角霜對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型小鼠抗炎作用研究*

陳臘霞1,王燕燕2,孫偉光3,許鑫4

(1.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,宜昌 443002;2.湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院藥劑科,宜昌 443002;3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,武漢 430030;4.湖北中醫(yī)藥大學(xué),武漢 430065)

目的 觀察復(fù)方鹿角霜對(duì)小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)體內(nèi)相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)及滑膜組織病理學(xué)的影響。方法建立小鼠CIA模型,實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組,模型對(duì)照組,復(fù)方鹿角霜總膏低、高劑量組(C1,C2組),雷公藤多苷片組。小鼠第一次免疫后,觀察小鼠的一般情況,記錄小鼠前后足爪病變發(fā)生情況。小鼠第二次免疫后,復(fù)方鹿角霜C1、C2組分別灌胃給予復(fù)方鹿角霜總膏2.5,5 g·kg-1·d-1,雷公藤多苷片組灌胃給予雷公藤多苷片13.6 g·kg-1·d-1,連續(xù)4周。小鼠給藥結(jié)束后,取血分離血清,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)小鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-4(IL-4)的表達(dá)水平。取小鼠足踝關(guān)節(jié),光鏡觀察關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)變化。結(jié)果與模型對(duì)照組比較,復(fù)方鹿角霜C1、C2組、雷公藤多苷片組血清TNF-α均明顯降低;而復(fù)方鹿角霜組血清IL-4水平升高。模型對(duì)照組關(guān)節(jié)病理可見(jiàn)滑膜組織增生,各給藥組關(guān)節(jié)病理形態(tài)有所改善。結(jié)論復(fù)方鹿角霜可減輕膠原誘發(fā)的小鼠關(guān)節(jié)炎紅腫癥狀,其作用機(jī)制可能與降低炎性因子TNF-α、調(diào)節(jié)抑炎因子IL-4作用有關(guān)。

鹿角霜,復(fù)方;關(guān)節(jié)炎;膠原,Ⅱ型;細(xì)胞因子

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是目前嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的自身免疫性疾病,其病因尚不明確,可能與遺傳、環(huán)境及感染等因素相關(guān)。中醫(yī)將類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎歸屬于痹癥,患者多因體虛與濕熱、淤血互結(jié),導(dǎo)致類(lèi)風(fēng)濕臨床癥狀的產(chǎn)生。《金匱要略》認(rèn)為營(yíng)衛(wèi)不和是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎常見(jiàn)病機(jī),營(yíng)衛(wèi)氣血即中醫(yī)免疫系統(tǒng),調(diào)和營(yíng)衛(wèi)法被廣泛的用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。同時(shí)現(xiàn)代免疫學(xué)認(rèn)為,RA屬于炎癥性自身免疫性疾病,而以細(xì)胞因子為靶點(diǎn)的免疫治療,已成為RA疾病治療切入點(diǎn)。復(fù)方鹿角霜處方為宜昌市中心人民醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)方,來(lái)源于臨床有效方劑鹿角霜抗風(fēng)濕復(fù)方,而其抗炎作用機(jī)制尚不明確。筆者在本實(shí)驗(yàn)中探討復(fù)方鹿角霜對(duì)膠原誘導(dǎo)性小鼠血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-4及關(guān)節(jié)組織的影響,明確其可能的抗炎作用機(jī)制,為研究復(fù)方鹿角霜的治療作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)Balb/c小鼠,雄性,體質(zhì)量(18±2)g,由湖北省疾病控制中心提供,合格證號(hào): SCXK2008-0005。動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房,環(huán)境溫度(22±2)℃,相對(duì)濕度(55±5)%,12 h光暗循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)條例進(jìn)行。

1.2 試劑 復(fù)方鹿角霜(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院研究室提取制備),雷公藤多苷片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司,批號(hào):Z31020415),羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):F20101222),牛Ⅱ型膠原(Sigma公司,批號(hào):C7806),完全弗氏佐劑(Sigma公司,批號(hào):F5881);不完全弗氏佐劑(Sigma公司,批號(hào): F5506);TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA)試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司,批號(hào):EK0527);IL-4 ELISA試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司,批號(hào):EK0405)。

1.3 主要儀器 電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司),高速離心機(jī)(TG16A-WS),加樣器(Eppendorf research,1 000,200,10 μL),光學(xué)顯微鏡(Olympus, BH-2,Japan),-20℃低溫冰箱(SIEMENS)。

1.4 動(dòng)物分組 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3～5 d,通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法,將小鼠分為空白對(duì)照組、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)模型對(duì)照組、復(fù)方鹿角霜低劑量組(C1組)、復(fù)方鹿角霜高劑量組(C2組)、雷公藤多苷片組共5組,每組10只。

1.5 藥物的制備 中藥鹿角霜抗風(fēng)濕復(fù)方提取物:取鹿角霜、蜂房、鹿銜草、忍冬藤、桑枝、桂枝藥材,12倍水浸泡藥材1 h,煎煮2次,每次3 h。經(jīng)減壓濃縮、真空干燥、粉碎,過(guò)篩孔內(nèi)徑0.180 mm(80目)篩,即得復(fù)方鹿角霜提取物,本品呈棕灰色粉末狀。雷公藤多苷片劑,研磨成粉末狀。0.5%羧甲基纖維素鈉混懸,得藥物混懸液。

1.6 造模 4組Balb/c雄性小鼠[1-2],造模,隨機(jī)留1組作為空白對(duì)照組。造模前1 d,將牛Ⅱ型膠原溶于0.1 mol·L-1的醋酸溶液中,終濃度2 mg·mL-1,置于4℃冰箱中過(guò)夜備用。將溶解的牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑等體積混合,低溫條件下充分乳化。將乳化完全的乳滴于Balb/c小鼠尾根部皮內(nèi)注射100 μL,進(jìn)行初次免疫,造模當(dāng)天記為實(shí)驗(yàn)第1天。第21天將牛Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑等體積混合,用同樣的方法進(jìn)行第2次免疫[3-5]?？瞻讓?duì)照組給予0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行免疫。小鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫表現(xiàn)或畸形即為實(shí)驗(yàn)造模成功[6-7]。

1.7 給藥方法 第2次免疫完成后,第22天小鼠開(kāi)始灌胃給藥?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組給與等體積0.5%羧甲基纖維素鈉;C1組和C2組分別給予復(fù)方鹿角霜250,500 mg·mL-1,雷公藤多苷片組給予1.36 mg·mL-1雷公藤多苷片。灌胃前混懸均勻,小鼠灌胃量按0.1 mL·(10 g)-1給藥,連續(xù)灌胃4周。

1.8 指標(biāo)檢測(cè) 最后一次給藥結(jié)束后,小鼠摘取眼球取血,取血量約1.0 mL。血液室溫靜置1 h, 3 000 r·min-1離心10 min。取上層血清,分裝于EP管中,置-20℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩LISA測(cè)定血清TNF-α、IL-4水平,嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行。

1.9 小鼠后踝關(guān)節(jié)病理學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,小鼠脫臼處死,剝離切取各組右側(cè)踝關(guān)節(jié),立即放入10%甲醛溶液中。常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,蘇木精-伊紅染色。光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)組織的病理變化,主要從滑膜細(xì)胞增殖、炎癥和骨質(zhì)侵蝕等方面進(jìn)行觀察。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0版軟件進(jìn)行分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠大體情況變化 小鼠第1次免疫后,空白對(duì)照組小鼠尾根部紅腫很快恢復(fù)正常;模型對(duì)照組小鼠尾根部表現(xiàn)紅腫,有些出現(xiàn)明顯的潰爛,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍無(wú)好轉(zhuǎn)。

2.2 小鼠前后足爪病變情況 第30天小鼠足爪開(kāi)始出現(xiàn)紅腫,有的表現(xiàn)為足趾紅腫,有的表現(xiàn)為足掌紅腫。小鼠足爪腫脹一直存在,持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。說(shuō)明牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎造模成功,可以為本實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)復(fù)方鹿角霜對(duì)CIA模型的治療作用提供參考。

2.3 復(fù)方鹿角霜對(duì)小鼠血清TNF-α和IL-4的影響與模型對(duì)照組比較,C1組、C2組小鼠血清TNF-α明顯降低(P＜0.01);C1組小鼠血清中IL-4水平含量增加(P＜0.01),C2組IL-4水平含量有增加的趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 5組小鼠血清TNF-α、IL-4比較Tab.1 Comparison of serum levels of TNF-α and IL-4 in five groups of mice

2.4 關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)的變化 空白對(duì)照組小鼠關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),如圖1A所示;模型對(duì)照組小鼠滑膜組織明顯增厚,滑膜內(nèi)血管豐富,如圖1B所示;而各給藥組小鼠滑膜細(xì)胞增生、血管炎表現(xiàn)在一定程度上減輕,如圖1C、D、E所示。見(jiàn)圖1。

3 討論

RA屬中醫(yī)“痹癥”范疇,正氣不足是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病的根本,邪氣入侵是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病條件,基本病機(jī)是素體本虛,氣血不足,肝腎虧損,風(fēng)寒濕邪痹阻脈絡(luò)[8]。RA病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確,但病理改變的靶器官以關(guān)節(jié)滑膜為主,同時(shí)伴隨著全身免疫系統(tǒng)的活化。復(fù)方鹿角霜處方是醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)方,來(lái)源于臨床有效方劑鹿角霜抗風(fēng)濕復(fù)方,由鹿角霜、蜂房、鹿銜草、忍冬藤、桑枝、桂枝6味藥組成。以鹿角霜為君,補(bǔ)腎助陽(yáng),活血通脈;以鹿銜草、忍冬藤為臣,強(qiáng)筋健骨,祛風(fēng)除濕,疏利關(guān)節(jié);以蜂房為佐,祛風(fēng)止痛;以桑枝、桂枝為使,氣血通融,邪去正復(fù)。因而,如何借助現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn),明確鹿角霜抗風(fēng)濕復(fù)方治療RA活性及作用機(jī)制,尋找和開(kāi)發(fā)新的防治RA的藥物成為極待進(jìn)一步研究的問(wèn)題。研究表明,TNF-α促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子;趨使炎性細(xì)胞聚集于關(guān)節(jié)滑膜處;誘導(dǎo)軟骨、成纖維細(xì)胞合成和分泌膠原酶、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)等炎癥遞質(zhì);介導(dǎo)滑膜炎癥和軟骨破壞[9-11]。IL-4是一種具有多生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子,其抑炎作用主要通過(guò)以下途徑:調(diào)節(jié)多種RA不同類(lèi)型細(xì)胞活性,從而抑制TNF-α、IL-6等致炎因子的產(chǎn)生,同時(shí)也可抑制PGE2的表達(dá),控制炎癥的發(fā)生和發(fā)展;IL-4還可協(xié)同IL-10的抗炎作用[12-13]。通過(guò)對(duì)小鼠足趾和尾根部觀察,成功建立了小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在治療實(shí)驗(yàn)中,用乳化完全的乳滴對(duì)Balb/c小鼠尾根部進(jìn)行兩次皮內(nèi)注射,可以制作穩(wěn)定的小鼠關(guān)節(jié)炎模型。ELISA法結(jié)果顯示,模型對(duì)照組血清TNF-α含量上升,IL-4含量下降。表明炎性因子TNF-α和IL-4參與了膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生過(guò)程,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。而復(fù)方鹿角霜治療后,各治療組血清TNF-α含量明顯少于模型對(duì)照組,說(shuō)明復(fù)方鹿角霜可抑制膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠血清TNF-α的表達(dá)。復(fù)方鹿角霜組小鼠血清IL-4水平高于模型對(duì)照組,但高劑量組有升高趨勢(shì),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病理結(jié)果顯示:模型對(duì)照組滑膜組織增生明顯、炎性細(xì)胞浸潤(rùn);復(fù)方鹿角霜治療后,滑膜組織增生輕于模型對(duì)照組。表明復(fù)方鹿角霜可抑制小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。由此可見(jiàn),復(fù)方鹿角霜減輕小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎可能與調(diào)節(jié)小鼠血清TNF-α和IL-4表達(dá)有關(guān)。

A.空白對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.C1組;D.C2組;E.雷公藤多苷片組圖1 光鏡下5組小鼠關(guān)節(jié)組織的結(jié)構(gòu)變化(HE,×100)A.blank control group;B.model control group;C.group C1;D.group C2;E.glucosidorum tripterygll totorum groupFig.1 Pathological changes of articular tissues in five groups of mice by light microscope(HE,×100)

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.003

Anti-inflammatory Effect of Compound Cornu Cervi Degelatinatum on Collagen-induced Arthritis Model of Mice

CHEN La-xia1,WANG Yan-yan2,SUN Wei-guang3,XU Xin4
(1.The First College of Clinical Medical Science, China Three Gorges University,Yichang 443002,China;2.Department of Pharmacy,Yichang Central People's Hospital,Yichang 443002,China;3.School of Pharmacy,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;4.Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065, China)

Objective To investigate the effects of compound cornu cervi degelatinatum on the expression of related inflammatory cytokines and pathological changes of the synovium in mice with collagen-induced arthritis(CIA).MethodsThe CIA model of Balb/c mice was established.The mice were randomly divided into 5 groups:blank control group,model control group,low-dose group(C1),high-dose group(C2)and glucosidorum tripterygll totorum group D.After the first immunization in mice,we observed the general condition and lesions of the fore and hind jaws.After the second immunization, the mice in groups C1 and C2 were orally administered with compound cornu cervi degelatinatum at the doses of 2.5 and 5 g·kg-1body weight per day for 4 weeks,and meanwhile those in group D were administrated with glucosidorum tripterygll totorum at the dose of 13.6 mg·kg-1body weight per day.The serum of the mice was collected to detect the levels of TNF-α and IL-4 by ELISA.Ankle joints were harvested,and the pathological changes of synovial tissues were observed under light microscope.ResultsAs compared with the model control group,the level of TNF-α in the treatment groups was significantly decreased,while the level of IL-4 was elevated in group C1.Histological pathology of ankle joints demonstrated that the synovium of the CIA mice were hyperplastic and the synovial tissues were markedly ameliorated in treatment groups.ConclusionThe compound cornu cervi degelatinatum can relieve redness and swelling in mice with CIA.The mechanism may be related to the inhibition of pro-inflammatory cytokine TNF-α and regulation of anti-inflammatory cytokine IL-4.

Cornu cervi degelatinatum,compound;Arthritis;Collagen,typeⅡ;Cytokine

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)08-0988-04

2013-04-19

2013-12-03

*國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(2011ZX09102-006-05)

陳臘霞(1986-),女,湖北監(jiān)利人,藥師,碩士,研究方向:藥理學(xué)。電話:(0)18986774195,E-mail:chenlaxia103 @126.com。

王燕燕(1964-),女,湖北宜昌人,主任藥師,碩士生導(dǎo)師,博士,主要從事中藥藥效學(xué)、醫(yī)院藥學(xué)研究。電話:0717-6487741,E-mail:wangyy1001@163.com。