單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化朱砂根總皂苷的提取工藝

吳琴,陳珣

(1.貴州理工學(xué)院制藥工程學(xué)院,貴陽(yáng) 550003;2.畢節(jié)學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院,畢節(jié) 551700)

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化朱砂根總皂苷的提取工藝

吳琴1,陳珣2

(1.貴州理工學(xué)院制藥工程學(xué)院,貴陽(yáng) 550003;2.畢節(jié)學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院,畢節(jié) 551700)

目的 優(yōu)化朱砂根的最佳提取工藝,為朱砂根的研究提供基礎(chǔ)。方法以朱砂根總皂苷的含量為指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn),優(yōu)化朱砂根的最佳提取工藝。結(jié)果單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化得到的朱砂根最佳提取工藝為:以70%乙醇為溶劑,提取溫度70℃,料液比為1∶16,提取時(shí)間為3 h,在此條件下,總皂苷百分含量的理論預(yù)測(cè)值為2.29%。結(jié)論通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到的朱砂根總皂苷提取工藝穩(wěn)定、可靠,具有一定的實(shí)用價(jià)值。

朱砂根;總皂苷;響應(yīng)面法;提取工藝

朱砂根為紫金?？谱辖鹋僦参?是《中華人民共和國(guó)藥典》1977年版收載的紫金牛屬兩種藥用植物之一[1],主要分布于我國(guó)浙江、湖南、湖北、重慶、四川、貴州、云南、廣東和廣西等省區(qū)。藥效學(xué)研究表明,朱砂根總皂苷具有明顯抑制癌細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫力、抗炎抑菌、抗病毒等作用,朱砂根所含三萜皂苷有興奮子宮、抗早孕的作用[2-5]。響應(yīng)面法已廣泛用于中藥有效成分的提取工藝研究[6-8]。為了系統(tǒng)詳盡地研究黔產(chǎn)朱砂根總皂苷的提取工藝,筆者在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面法對(duì)其提取條件進(jìn)行優(yōu)化,為其進(jìn)一步開發(fā)和利用提供有價(jià)值的工藝參數(shù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海秼馬恒溫設(shè)備廠);DF-4電磁式礦石粉碎機(jī)(杭州卓馳有限公司);AUY220電子分析天平(日本島津公司); SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠); HH-4恒溫水浴鍋(金壇市宏華儀器廠);SHT型攪拌數(shù)顯恒溫電熱套(菏澤市牡丹區(qū)大華儀器有限公司);Cary 50紫外-可見分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安中國(guó)有限公司)。

1.2 試藥 實(shí)驗(yàn)所用朱砂根購(gòu)于貴陽(yáng);標(biāo)準(zhǔn)品人參皂苷RG1購(gòu)于上海金穗生物科技有限公司;無(wú)水乙醇、石油醚、甲醇、冰醋酸、高氯酸、香蘭素均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 朱砂根總皂苷含量的測(cè)定方法

2.1.1 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取人參皂苷RG1標(biāo)準(zhǔn)品1.7 mg,甲醇溶解定容至10 mL,配制成0.17 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述人參皂苷RG1標(biāo)準(zhǔn)液0.0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL于10 mL量瓶中,然后加入5%香蘭素-冰醋酸溶液0.1 mL,高氯酸0.25 mL,搖勻后置于60℃恒溫水浴鍋加熱反應(yīng)40 min,冷卻5 min后加入冰乙酸1 mL,搖勻,80%甲醇定容,搖勻,靜置15 min[9]。以80%甲醇溶劑作空白參比進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,供試品溶液在540 nm處有最大吸收。故選擇540 nm為測(cè)定波長(zhǎng),測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度(A),然后以人參皂苷濃度(C)為橫坐標(biāo),A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程A= 11.740C-0.147(r=0.999 7)。

2.1.2 樣品含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取處理過的朱砂根樣品于50 mL圓底燒瓶中,加入70%乙醇后加熱提取,抽濾定容至50 mL搖勻,得供試品溶液。將供試品溶液減壓濃縮至原來體積的1/3后用石油醚萃取,脫去脂溶性成分,收集含朱砂根粗皂苷的浸提濃縮液。準(zhǔn)確移取0.2 mL濃縮液于10 mL量瓶中,其余步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法相同,測(cè)其吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算出皂苷的濃度,進(jìn)而可以得到朱砂根中總皂苷的百分含量。

式中,W為樣品質(zhì)量,C為皂苷溶液濃度,Y為朱砂根總皂苷的百分含量,50為所取測(cè)定溶液的倍數(shù)。

2.2 單因素考察

2.2.1 料液比的考察 按照“2.1.2”項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)步驟,其他條件不變,料液比分別考察了1∶8,1∶12,1∶16,1∶20及1∶24。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,總皂苷百分含量隨著料液比的增大而增加,當(dāng)料液比為1∶16時(shí),總皂苷得率較大,而再增加溶劑體積總皂苷的含量有所降低,因此選擇1∶16為提取總皂苷的最佳料液比。

2.2.2 提取時(shí)間的考察 按照“2.1.2”項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)步驟,其他條件不變,提取時(shí)間分別考察了2.0,2.5, 3.0,3.5,4.0 h。結(jié)果顯示,總皂苷得率一開始隨著提取時(shí)間的增大而增加,而當(dāng)提取時(shí)間為3.5 h后有所下降,因此提取時(shí)間選3 h。

2.2.3 提取溫度的考察 按照“2.1.2”項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)步驟,其他條件不變,提取溫度分別考察了60,65,70, 75,80℃。結(jié)果顯示,總皂苷得率隨著溫度的上升而增大。當(dāng)溫度為70℃時(shí),總皂苷得率最大,繼續(xù)升高溫度,總皂苷得率沒有明顯提高,因此提取溫度控制在70℃。

2.3 響應(yīng)面法確定朱砂根總皂苷提取最佳工藝條件

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn),選擇料液比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素,分別以X1、X2、X3表示,每一個(gè)自變量的低、中、高實(shí)驗(yàn)水平分別以-1,0,1進(jìn)行編碼,以皂苷得率(Y)為響應(yīng)值,各因素編碼值見表1,實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3.2 擬合回歸方程的建立 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸,以得率(Y)為因變量,料液比(X1)、浸提時(shí)間(X2)、提取溫度(X3)為自變量,建立回歸方程如下:

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。從表3可知回歸顯著,一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)都是顯著的,且方程的失擬項(xiàng)很小,表明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況好,實(shí)驗(yàn)誤差小。因此,可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,各具體實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表1 響應(yīng)面分析因子和水平表Tab.1 Factorsandlevelsofresponsesurface experiments

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Tab.2 Projectsandresultsofresponsesurface experiment

2.3.3 響應(yīng)面圖解析 根據(jù)回歸方程繪制出響應(yīng)面曲圖,通過響應(yīng)曲面圖可分析當(dāng)料液比、浸提時(shí)間、提取溫度其中一個(gè)因素固定時(shí),另外兩個(gè)因素對(duì)朱砂根總皂苷含量影響,結(jié)果見圖1。從圖1A可以得知,在料液比的量較低時(shí),隨時(shí)間的增加總皂苷的百分含量逐漸增多,當(dāng)料液比的量發(fā)生變化時(shí),總皂苷百分含量逐漸增加,但不顯著。從圖1B得知,料液比和提取溫度對(duì)總皂苷的影響也是如此。圖1C可以看出,浸提時(shí)間對(duì)總皂苷得率的影響沒有提取溫度的顯著,但其等高線為橢圓,說明浸提時(shí)間和提取溫度交互作用顯著。

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果Tab.3 Variance analysis on regression equation

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以朱砂根總皂苷含量為指標(biāo),通過Design-Expert 8.05軟件分析,得到總皂苷的最佳提取條件為:采用70%的乙醇為溶劑,提取溫度70℃,料液比為1∶16,提取時(shí)間為3 h。在此條件下,總皂苷百分含量的理論預(yù)測(cè)值為2.29%。為了驗(yàn)證模型方程的適用性和可靠性,采用上述工藝條件進(jìn)行總皂苷提取實(shí)驗(yàn),在此條件下進(jìn)行了3次平行實(shí)驗(yàn),總皂苷平均含量為2.28%(理論預(yù)測(cè)值為2.29%)。方差分析結(jié)果表明二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),與預(yù)測(cè)值基本相符,說明此方程與實(shí)際情況擬合很好,充分驗(yàn)證了模型的合理性。

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)分別考察了提取溫度、料液比、提取時(shí)間對(duì)朱砂根總皂苷含量的影響,并應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)朱砂根總皂苷的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明提取時(shí)間、料液比、提取溫度對(duì)朱砂根中總皂苷得率的影響不是單一的線性關(guān)系?；貧w分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明了該響應(yīng)面法的合理性和可行性,有一定的使用價(jià)值。響應(yīng)面法優(yōu)化提取朱砂根總皂苷,不僅節(jié)省了大量的時(shí)間和溶劑,而且操作簡(jiǎn)單,提取的藥液雜質(zhì)少,有效成分易于分離、純化,提取溫度低,還能有效地保護(hù)活性物質(zhì)的成分,提高了經(jīng)濟(jì)效益,為今后有效利用朱砂根資源提供了一種實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的方法。

圖1 料液比與浸提時(shí)間(A)、料液比與提取溫度(B)和提取時(shí)間與浸提溫度(C)交互影響總皂苷得率曲面圖Fig.1 Kyrtograph on interaction affect of solid-liquid ratio and extraction time(A)、solid-liquid ratio and extraction temperature(B)and extraction time and extraction temperature(C)on total saponins yeild

[1] 梁克明,王四旺,王曉娟.九節(jié)龍?jiān)碥諏?duì)8株人癌細(xì)胞的抑制作用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,22(7):671-672.

[2] 關(guān)雄泰,汪茂田,宮予敏,等.朱砂根中皂苷元及次生苷的研究[J].中草藥,1987,18(8):2-4.

[3] 宿樹蘭,李永輝,歐陽(yáng)臻,等.紫金牛屬藥用植物中三萜皂苷成分的研究進(jìn)展[J].中藥材,2003,26(2):144-148.

[4] 海文利,湯海峰,馬寧,等.紫金牛屬植物中皂苷的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2012,24(10):1474-1479.

[5] 張偉,李錕,李東,等.朱砂根化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(11):279-282.

[6] 李璐,吳文錦,黃鳳洪,等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取竹節(jié)參總皂苷的工藝條件[J].食品科技,2010,35(6):222-226.

[7] 劉劍青,肖小年,許英偉,等.響應(yīng)面法優(yōu)化藠頭中皂苷的提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(1):253-256.

[8] 吳祥庭,朱濤,鄭巧敏,等.響應(yīng)面法優(yōu)化山藥皮中皂苷提取的研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2011,26(6):91-96.

[9] 李文仕.分光光度法測(cè)定三七傷藥膠囊中三七總皂苷的含量[J].黑龍江醫(yī)藥雜志,2010,23(1):5-7.

DOI 10.3870/yydb.2014.08.028

Optimization of Extraction Technology for Total Saponins of Ardisia Crenata by Singlefactor Experiment Combined with Response Surface Methodology

WU Qin1,CHEN Xun2
(1.School of Pharmaceutical Engineering,Guizhou Institute of Technology,Guiyang 550003,China;2.School of Chemical Engineering,Bijie University,Bijie 551700,China)

Objective To optimize the extraction process ofArdisia crenatabased on the content of total saponins and to provide a basis for theArdisia crenatastudy.MethodsBased on the results of the single-factor tests and the Box-Behnken central composite experimental design principles,a response surface methodology which has three factors and three levels was designed to optimize the extraction process ofArdisia crenatabased on the content of saponins.ResultsA maximal extraction yield of total saponins reached 2.29%under the optimal conditions as follows:70%alcohol was used as extraction solvent with the material to liquid ratio of 1∶16,the extraction time was 3 h at 70℃.ConclusionThe optimized extraction process is accurate,reliable and practically valuable.

Ardisia crenata;Total saponins;Response surface methodology;Optimization of extraction

R282.71;TQ460.6

A

1004-0781(2014)08-1080-03

2013-09-24

2013-12-02

吳琴(1974-),女,貴州貴陽(yáng)人,副教授,博士,主要從事新農(nóng)藥設(shè)計(jì)與合成。電話:(0)18212819544,E-mail: wuqin1974@163.com。