雙黃連粉針劑超聲霧化前后3種成分的質(zhì)量分析*

韓飛,肖雄,王勍,陳式誠,羅曉健

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南昌 330004;2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程中心,南昌 330006)

雙黃連粉針劑超聲霧化前后3種成分的質(zhì)量分析*

韓飛1,肖雄1,王勍1,陳式誠1,羅曉健2

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南昌 330004;2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程中心,南昌 330006)

目的 建立雙黃連粉針劑超聲霧化液中綠原酸、連翹苷、黃芩苷反向-高效液相色譜(RP-HPLC)同步測定的新方法。方法色譜柱Hypersil ODS2 C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水溶液(40∶60),流速1.0 mL·min-1,進(jìn)樣量5 μL,柱溫30℃,檢測波長0～10 min為324 nm,10～25 min為277 nm。結(jié)果綠原酸、連翹苷、黃芩苷分別在進(jìn)樣量范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好,r≥0.999 7,精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均RSD＜2%,回收率98.50%～101.12%(n=6)。結(jié)論該方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、分離度高,可同時(shí)測定3種成分的含量。雙黃連粉針劑超聲霧化前后3種成分變化不大。

雙黃連粉針劑;綠原酸;連翹苷;黃芩苷;超聲,霧化;分析,質(zhì)量

雙黃連粉針劑是由金銀花、黃芩、連翹提取物制成的中藥制劑,具有清熱解毒、宣肺散風(fēng)的功效,用于治療病毒及細(xì)菌感染引起的扁桃體炎、咽炎、急性支氣管炎、肺炎等疾病。從1990年雙黃連粉針劑批準(zhǔn)上市至今已近24年,在其療效被肯定的同時(shí)也出現(xiàn)了大量的藥物不良反應(yīng)(adverse drug reactions,ADR)報(bào)道[1]。2009年2月12日和2009年9月16日,因其嚴(yán)重不良事件,國家食品藥品監(jiān)督管理局兩次暫停部分企業(yè)生產(chǎn)的雙黃連粉針劑的銷售和使用[2-4]。雙黃連制劑注射給藥不良反應(yīng)的發(fā)生率比其他給藥途徑高出5倍多[5-6]。袁強(qiáng)等[7]的研究結(jié)果也表明,雙黃連注射劑ADR位居2004年版《國家基本藥物目錄》中33種中藥注射劑之首。近年來,為了避免雙黃連粉針劑的不良反應(yīng),臨床上通常采用超聲霧化吸入的給藥方法,并取得較好的效果[8-10]。但目前大多數(shù)報(bào)道只反映其霧化吸入的實(shí)際療效,而很少從制劑基礎(chǔ)研究的層面上去探討其霧化吸入的可行性。筆者建立了測定雙黃連粉針劑超聲霧化液中黃芩苷、連翹苷、綠原酸的含量檢測方法,并對比雙黃連粉針劑超聲霧化前后3種成分含量的變化,初步研究了其霧化吸入的可行性。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 魚躍牌4021AI超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司,蘇藥管械準(zhǔn)字2002第223),EPED-20TH純水器(上海精密儀表有限公司),KQ5200DA超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司,感量0.01 mg),Agilent-1200高效液相色譜儀:Agilent-1200泵,Agilent-1200-VWD檢測器,Agilent-1200化學(xué)工作站。

1.2 試劑 黃芩苷對照品,連翹苷對照品,綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院提供,批號:110715-201117,110713-201108,110753-201214),雙黃連粉針劑(哈藥集團(tuán)中藥二廠,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z10940044,規(guī)格:600 mg),甲醇(色譜純,天津市永大化學(xué)試劑廠),磷酸(分析純,天津市永大化學(xué)試劑廠),水為超純水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil 0DS2 C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm,大連依利特公司);流動(dòng)相甲醇-0.2%磷酸水溶液(40∶60);流速1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量5 μL;柱溫30℃;檢測波長0～10 min,324 nm;10～25 min,277nm。綠原酸的保留時(shí)間(tR)3.46 min,連翹苷的保留時(shí)間(tR)13.33 min,黃芩苷的保留時(shí)間(tR)17.50 min。在上述色譜條件下,3種成分與相鄰成分有較好的分離,各成分理論板數(shù)均＞4 000。見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、連翹苷、黃芩苷對照品適量,色譜純甲醇溶解,置10 mL量瓶中,稱質(zhì)量,超聲20 min,放冷,甲醇補(bǔ)足失重,用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得綠原酸(0.331 mg·mL-1)、連翹苷(0.203 mg·mL-1)、黃芩苷(0.148 mg·mL-1)的混合對照品溶液。

2.2.2 雙黃連粉針(水)溶液的制備 精密稱取干燥的雙黃連粉針劑500.0 mg,超純水溶解,置500 mL量瓶中,稱質(zhì)量,超聲兩次,每次15 min,放冷,超純水補(bǔ)足失重,用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得雙黃連粉針(水)溶液(1.0 mg·mL-1)。

2.2.3 雙黃連粉針劑超聲霧化液的收集 取干燥的錐形瓶一個(gè),置于裝滿500 mL水的燒杯中,冷凍12 h,取出,將同口徑的霧化導(dǎo)管接于錐形瓶上,密封膜纏封,經(jīng)檢查氣密性良好。大霧化杯中裝入約500 mL超純水,小霧化杯中加入“2.2.2”項(xiàng)下制備的150 mL溶液,蓋上頂蓋,頻率調(diào)至1.7 MHz±10%,霧化量調(diào)至4 mL·min-1,打開電源,霧化30 min后,關(guān)閉電源,轉(zhuǎn)移至40℃恒溫水浴鍋中加熱,收集所得霧化液,用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得雙黃連超聲霧化液。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取綠原酸(0.331 mg·mL-1)、連翹苷(0.203 mg·mL-1)、黃芩苷(0.148 mg·mL-1)對照品溶液,各0.1,1,2,4,6,8, 10 mL,分別置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,定容,分別精密吸取溶液各10 μL,注入色譜儀,記錄峰面積,以峰面積(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明在進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表1。

A.混合對照品;B.供試品;1.綠原酸;2.連翹苷;3.黃芩苷圖1 對照品和供試品HPLC色譜圖A.mixed reference substance;B.samples;1.chlorogenic acid; 2.forsythin;3.baicalinFig.1 HPLC of reference substance and samples

表1 3種成分線性關(guān)系和范圍Tab.1 Linearrelationshipandrangeofthree components

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液10 μL,在上述色譜條件下,連續(xù)進(jìn)樣6次,測定峰面積。結(jié)果顯示綠原酸、連翹苷、黃芩苷峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.625%,0.449%,0.903%,表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)方法平行制成6份超聲霧化液(批號:20120923),在上述色譜條件下,進(jìn)樣10 μL,測定峰面積。結(jié)果顯示綠原酸、連翹苷、黃芩苷峰面積RSD分別為1.14%,1.53%, 1.31%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一超聲霧化液(批號20120923)10 μL,分別于0,2,4,8,12,24 h,在上述色譜條件下,測定峰面積。結(jié)果顯示綠原酸、連翹苷、黃芩苷峰面積RSD分別為1.27%,1.09%,1.42%。表明超聲霧化液樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取18份任意批號的雙黃連粉針劑,分成3組,每組6份,分別加入各對照品適量,按“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)的方法制備成樣品溶液,精密吸取樣品溶液10 μL。上述色譜條件下,測定峰面積,各成分回收率在98.50%～101.12%。綠原酸、連翹苷、黃苓苷平均回收率依次為99.49%, 99.77%,99.29%;RSD依次為0.849%,0.812%, 0.966%。結(jié)果見表2。

表2 綠原酸、連翹苷、黃芩苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Recovery results of chlorogenic acid,forsythin and baicalin

2.8 樣品測定 按“2.2.2”項(xiàng)方法制備成供試品5批,在按照“2.2.3”項(xiàng)方法制備成超聲霧化液,精密吸取10 μL,在上述色譜條件下測定,按照外標(biāo)法計(jì)算各成分的含量。結(jié)果見表3。

2.9 超聲霧化前后3種成分含量變化 按照“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)的方法,各制備一批樣品溶液,分別吸取上述兩種溶液各10 μL,在上述色譜條件下測定,記錄色譜峰面積,測定各成分的含量等。見表4。

表3 不同批號樣品綠原酸、連翹苷、黃芩苷測定結(jié)果Tab.3 Determinationresultsofchlorogenicacid, forsythin and baicalin from different batch samples mg·mL-1

表4 超聲霧化前后綠原酸、連翹苷、黃芩苷含量變化Tab.4 Content changes of chlorogenic acid,forsythin and baicalin before and after ultrasonic atomization

3 討論

3.1 波長的選擇 對于多成分的含量測定,波長的選擇是關(guān)鍵。經(jīng)過紫外掃描,綠原酸、連翹苷、黃芩苷的最大吸收波長分別為324,277,274 nm。由于樣品中黃芩苷含量很高,大大超過其他兩種成分,因此將一段檢測波長設(shè)為277 nm,既能將連翹苷的含量有效的測出,又基本不影響黃芩苷的含量值;此外,將另一段檢測波長定為324 nm,較利于綠原酸的含量測定,且分離效果非常顯著,故最終采用0～10 min,324 nm;10～25 min,277 nm雙波長檢測法。

3.2 溶劑的選擇 由于在臨床上,雙黃連粉針劑不管是注射給藥還是霧化吸入,大多采用注射用水或0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行溶解配制,為了與臨床實(shí)際情況盡可能一致,故本實(shí)驗(yàn)采用超純水作為溶劑。

3.3 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)曾嘗試過乙腈-水、甲醇-水等流動(dòng)相,結(jié)果分離效果不好。最終確定采用甲醇-0.2%磷酸水(40∶60),此單一流動(dòng)相可同時(shí)分離3種成分,且該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、分離度高,所用時(shí)間僅為25 min,比文獻(xiàn)報(bào)道[11-14]的梯度程序洗脫所用時(shí)間(至少60 min)大大縮短。

3.4 收集裝置的選擇 在現(xiàn)用裝置前曾嘗試連接冰冷凍過的冷凝管,但霧化后小液滴的溫度較低,且為液態(tài),而非氣態(tài),所以使用熱交換法使其冷凝的方式幾乎無效,故采用本實(shí)驗(yàn)裝置,使小液滴在相對封閉的環(huán)境中達(dá)一定壓力從而凝聚為大液滴而形成霧化收集液。另霧化管中亦有霧化液殘留,收集量可觀,約占最終收集液的90%。同時(shí),霧化過程中,頂蓋出霧口有回流現(xiàn)象,故小霧化杯中存留的大量藥液有一部分也經(jīng)過了霧化過程,符合霧化吸入的條件。

3.5 超聲霧化參數(shù) 本實(shí)驗(yàn)所采用的超聲霧化參數(shù)(超聲頻率:1.7 MHz±10%;霧化量:4 mL·min-1;霧化時(shí)間:30 min),參考了相關(guān)文獻(xiàn)[15],與臨床上采用的參數(shù)基本一致,具有一定的代表性,但超聲霧化的頻率、霧化時(shí)間發(fā)生較大的變化后,或采用別的霧化方式[16]3種成分的含量是否變化還有待進(jìn)一步研究。

3.6 超聲霧化前后的變化 通過對比雙黃連粉針劑霧化前后3種成分的變化發(fā)現(xiàn),其含量的改變極小,出峰數(shù)基本相同,4號峰在霧化后消失,但由于其峰面積＜2,含量幾乎可以忽略不計(jì)。此結(jié)果為探討雙黃連粉針劑霧化吸入給藥的可行性提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.026

Quality Analysis of Three Components in Shuanghuanglian Powder for Injection Before and After Ultrasonic Atomization

HAN Fei1,XIAO Xiong1,WANG Qing1,CHEN Shi-cheng1,LUO Xiao-jian2
(1.College of Pharmacy,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,China;2.Chinese Medicine Solid Preparations National Engineering Research Center for Manufacturing Technology,Nanchang 330006,China)

Objective To establish a new RP-HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid,forsythin, and baicalin inshuanghuanglianpowder for injection after ultrasonic atomization.MethodsHypersil ODS2 C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)was used as the chromatographic column.The mobile phase was methanol-0.2%phosphate acid solution(40∶60). Flow rate was 1.0 mL·min-1.Sample volume was 5 μL.Column temperature was 30℃.Detection wavelength was 324 nm at 0-10 min and 277 nm at 10-25 min.ResultsContents of chlorogenic acid,forsythin,and baicalin had good linear relationship with the respective peak area(r≥0.999 7)within the scope of the sample volume.The RSD was＜2%for precision,reproducibility, and stability.Recovery rate was 98.50%-101.12%(n=6).ConclusionThe method is rapid,accurate and reproducible,with high resolution.It can determine the content of three kinds of components at the same time.The three components inshuanghuanglianpowder for injection did not change significantly before and after ultrasonic atomization.

Shuanghuanglianpowder injection;Chlorogenic acid;Forsythin;Baicalin;Ultrasonic,atomizetion; Inhalation,aerosol

R286;R927.2

A

1004-0781(2014)08-1073-04

2013-12-11

2014-02-18

*江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(GJJ13609);江西省科技廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20142BAB205083);江西中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(2012ZR027);江西省高等學(xué)校卓越人才培養(yǎng)計(jì)劃(制藥工程)

韓飛(1981-),男,江西廣豐人,講師,碩士,研究方向:中藥新劑型及新技術(shù)的研究。電話:0791-87118645, E-mail:hanfei8454871@163.com。

肖雄(1969-),男,江西贛州人,講師,碩士,研究方向:制藥工程及設(shè)備。電話:0791-87118645,E-mail: xzy1119@163.com。