液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人全血蘭地洛爾濃度*

俞蘊(yùn)莉,張全英,華雯妍,黃明,王蒙

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床藥理實(shí)驗(yàn)室,蘇州 215004)

·心血管疾病用藥專(zhuān)欄·

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人全血蘭地洛爾濃度*

俞蘊(yùn)莉,張全英,華雯妍,黃明,王蒙

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床藥理實(shí)驗(yàn)室,蘇州 215004)

目的 采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測(cè)定全血蘭地洛爾的濃度,為注射用鹽酸蘭地洛爾的人體藥動(dòng)學(xué)研究提供檢測(cè)手段。方法全血樣本加入甲硫酸新斯的明后經(jīng)乙腈沉淀蛋白,采用WATERS公司XTerra?RP18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,以乙腈∶10 mmol·L-1醋酸銨緩沖液(含0.1%甲酸)=36∶64(V/V)為流動(dòng)相,流速為1 mL·min-1;質(zhì)譜采用電噴霧離子化,正離子-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)蘭地洛爾(m/z510.5→423.1)和內(nèi)標(biāo)文拉法辛(m/z278.2→215.1)的濃度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果蘭地洛爾的全血濃度在1.010～2 020 μg·L-1范圍內(nèi)線性良好,定量下限為1.010 μg·L-1,批內(nèi)精密度RSD＜6.5%,批間精密度RSD＜4.8%,提取回收率為92.6%～100.9%。結(jié)論該樣品處理方法簡(jiǎn)便,測(cè)定方法靈敏、準(zhǔn)確,適用于注射用鹽酸蘭地洛爾的人體藥動(dòng)學(xué)研究。

蘭地洛爾;血藥濃度;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

鹽酸蘭地洛爾(landiolol hydrochloride)是由日本小野制藥工業(yè)株式會(huì)社研制開(kāi)發(fā)的新型超短效β1受體阻斷藥,其適應(yīng)證主要包括:①手術(shù)時(shí)心動(dòng)過(guò)速性心律不齊的緊急處置(心房纖維顫動(dòng)、心房撲動(dòng)和竇性心動(dòng)過(guò)速);②手術(shù)后循環(huán)動(dòng)態(tài)監(jiān)控下,心動(dòng)過(guò)速性心律不齊的緊急處置(心房纖維顫動(dòng)、心房撲動(dòng)和竇性心動(dòng)過(guò)速)。鹽酸蘭地洛爾在日本已被廣泛用于圍手術(shù)期各種原因?qū)е碌目焖傩托穆墒С５目刂啤Ｌm地洛爾是在艾司洛爾的化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上改造而得的新化合物。與艾司洛爾相比,蘭地洛爾對(duì)受體的選擇性更高,起效更快,消除更快,用量更少[1]。同時(shí),蘭地洛爾還具有心臟抑制作用輕等優(yōu)點(diǎn)。蘭地洛爾在中國(guó)人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究筆者未見(jiàn)報(bào)道,了解蘭地洛爾在中國(guó)人群中的藥動(dòng)學(xué)特征,有助于制定更為合理有效的臨床用藥方案。筆者旨在通過(guò)靈敏、準(zhǔn)確、高效的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法建立測(cè)定人全血蘭地洛爾濃度的方法,為注射用鹽酸蘭地洛爾的人體藥動(dòng)學(xué)研究提供檢測(cè)手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-MS/MS系統(tǒng):API-4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Applied Biosystem Sciex公司), Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為Analyst 1.4.2。

1.2 試藥 鹽酸蘭地洛爾對(duì)照品(重慶鼎聯(lián)制藥有限公司,批號(hào):T21-0907001,含量:100%);鹽酸文拉法辛(內(nèi)標(biāo))對(duì)照品(重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責(zé)任公司,批號(hào):05011901,含量:99.3%)。甲硫酸新斯的明(Sigma-Aldrich公司,批號(hào):BCBD8573V);乙腈(色譜純,美國(guó)TEDIA公司);甲酸(色譜純,美國(guó)TEDIA公司);醋酸銨(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);水為滅菌注射用水(安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司);空白人全血(本院血庫(kù)提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件 色譜柱:WATERS公司XTerra?RP18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱, Phenomenex Security GuardTMC18預(yù)柱;流動(dòng)相:乙腈∶10 mmol·L-1醋酸銨緩沖液(含0.1%甲酸)=36∶64 (V/V)組成;流速為1 mL·min-1;進(jìn)樣體積為10 μL;每個(gè)樣品的分析時(shí)間為3.5 min。多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè),電噴霧離子源,正離子,測(cè)定蘭地洛爾和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)離子分別為:m/z510.5→423.1和m/z278.2→215.1。質(zhì)譜參數(shù):碰撞氣(CAD)8 psi,簾氣(CUR)15 psi,霧化氣(Gas1)55 psi,輔助氣(Gas2)40 psi,噴霧電壓(IS) 3 500 V,霧化溫度(TEM)600℃。

2.2 溶液的制備 蘭地洛爾標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液:精密稱(chēng)取鹽酸蘭地洛爾對(duì)照品10.80 mg(相當(dāng)于蘭地洛爾10.10 mg),置10 mL量瓶中,加入乙腈定容至刻度,混勻得到1.010 mg·mL-1的蘭地洛爾標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液,以乙腈為溶劑,定量稀釋配制成0.010 10,0.030 30, 0.101 0,0.303 0,1.010,3.030,10.10,20.20 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。蘭地洛爾質(zhì)控工作液:精密稱(chēng)取鹽酸蘭地洛爾對(duì)照品10.80 mg(相當(dāng)于蘭地洛爾10.10 mg),置10 mL量瓶中,加入乙腈定容至刻度,混勻得到1.010 mg·mL-1的蘭地洛爾質(zhì)控儲(chǔ)備液,以乙腈為溶劑,定量稀釋配制成0.020 20,0.505 0,16.16 μg·mL-1的質(zhì)控工作液。文拉法辛(內(nèi)標(biāo))工作液:精確稱(chēng)取對(duì)照品鹽酸文拉法辛10.00 mg(含文拉法辛8.780 mg),置10 mL量瓶中,加注射用水定容至刻度,混勻得0.878 0 mg·mL-1的文拉法辛儲(chǔ)備液,以注射用水為溶劑,定量稀釋配制成87.80 μg·L-1的工作液。2 mg·mL-1甲硫酸新斯的明溶液的配制:精確稱(chēng)取甲硫酸新斯的明100 mg,置50 mL量瓶中,加水定容,混勻得2 mg·mL-1的甲硫酸新斯的明溶液。

2.3 全血樣本處理 在新鮮空白全血1 mL中,加入2 mg·mL-1的甲硫酸新斯的明溶液25 μL,混勻備用?？瞻兹看问褂们爸苽?制備后1 h內(nèi)用完。精密吸取含有甲硫酸新斯的明的全血樣本200 μL至 1.5 mL塑料離心管中,加入內(nèi)標(biāo)工作液50 μL,混勻,加入乙腈600 μL,渦旋1 min,于16 000 r·min-1、4℃離心8 min。取上清液100 μL加入注射用水100 μL,渦旋30 s混勻,進(jìn)樣10 μL。

2.4 方法特異性考察 空白全血、蘭地洛爾和內(nèi)標(biāo)文拉法辛對(duì)照品混合液及受試者服藥后的全血樣本進(jìn)行色譜分析。結(jié)果顯示:蘭地洛爾和內(nèi)標(biāo)文拉法辛保留時(shí)間約為2.17和2.27 min,內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。說(shuō)明本方法具有較高的特異性,能準(zhǔn)確測(cè)定全血中的蘭地洛爾。

2.6 精密度和準(zhǔn)確度 精密吸取空白全血180 μL,分別加入蘭地洛爾質(zhì)控工作液20 μL,制備含蘭地洛爾濃度分別為2.02,50.50,1 616 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥全血,每個(gè)濃度平行配制5份,按“2.3”項(xiàng)下操作并測(cè)定。每天一批,連續(xù)測(cè)定3批,每批隨行一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。記錄色譜圖、蘭地洛爾峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai。計(jì)算As和Ai的比值f(f=As/Ai),將f值代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測(cè)濃度。用Excel軟件單因素方差分析統(tǒng)計(jì)批內(nèi)和批間精密度,同時(shí)計(jì)算相對(duì)偏差,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 全血中蘭地洛爾批內(nèi)、批間精密度Tab.1 Inter-and intro-precision of landiolol in human blood ±s,n=15

表1 全血中蘭地洛爾批內(nèi)、批間精密度Tab.1 Inter-and intro-precision of landiolol in human blood ±s,n=15

加入濃度測(cè)得濃度(μg·L-1)批內(nèi)RSD批間RSD準(zhǔn)確度RE % 2.02 2.17±0.146.54.87.2 50.50 52.20±2.004.02.13.3 1 616.001 597.00±70.004.80.3-1.2

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別考察蘭地洛爾低、中、高濃度(2.020,50.50,1 616 μg·L-1)的標(biāo)準(zhǔn)含藥全血樣本于室溫放置1 h、待測(cè)樣品自動(dòng)進(jìn)樣器放置24 h,處理后上清液室溫放置6 h、-70℃反復(fù)凍融3次及-70℃保存至14 d條件下的穩(wěn)定性。以不同放置條件下樣品的實(shí)測(cè)值與加入值相比計(jì)算偏差。結(jié)果蘭地洛爾標(biāo)準(zhǔn)含藥全血樣本于室溫放置1 h測(cè)定濃度相對(duì)誤差分別為4.5%,-5.2%和-11.5%;待測(cè)樣品于自動(dòng)進(jìn)樣器放置24 h后,測(cè)定濃度RE分別為10.9%,4.7%和-3.9%;上清液樣品于室溫放置6 h的測(cè)定濃度RE分別為7.1%,6.8%和3.1%;-70℃反復(fù)凍融3次后的測(cè)定濃度RE分別為-6.1%,-0.7%和-10.5%; -70℃放置14 d的測(cè)定濃度計(jì)算RE分別為5.0%, -1.3%和-9.4%。提示,本試驗(yàn)所有樣品在上述條件下均穩(wěn)定。儲(chǔ)備液于2～8℃以及-40℃放置11 d后的實(shí)測(cè)濃度計(jì)算RE為-0.2%和-0.6%,提示,儲(chǔ)備液在2～8℃以及-40℃放置11 d后仍穩(wěn)定。

2.10 樣本的測(cè)定 1例健康受試者參加注射用鹽酸蘭地洛爾單次給藥人體藥動(dòng)學(xué)預(yù)試驗(yàn)。以125 μg·kg-1·min-1急速靜脈注射1 min后,以20 μg·kg-1·min-1靜脈內(nèi)持續(xù)給藥60 min。于急速靜脈注射給藥前(0 min)和急速給藥開(kāi)始后1 min,以及靜脈內(nèi)持續(xù)給藥開(kāi)始后1,2,5,10,15,30,60 min和持續(xù)給藥結(jié)束后2,5,10,15,20,40 min由肘靜脈采血2 mL,置裝有乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic aicd,EDTA)和甲硫酸新斯的明的真空采血管中,直接用冰浴冷卻,立即按“2.3”項(xiàng)下操作并測(cè)定全血中蘭地洛爾的濃度。受試者全血藥物濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖1。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要目的是為注射用鹽酸蘭地洛爾的人體藥動(dòng)學(xué)研究提供血藥濃度檢測(cè)方法。由于蘭地洛爾結(jié)構(gòu)中有一個(gè)酯鍵,能夠被血中酯酶迅速水解為無(wú)活性的代謝產(chǎn)物,在血樣前處理中,采用在全血中加入膽堿酯酶抑制藥甲硫酸新斯的明抑制蘭地洛爾的降解[2-3]。本實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度(2,5 μg·mL-1和0.02,0.1,0.5, 2 mg·mL-1)甲硫酸新斯的明處理全血樣本,在室溫放置不同時(shí)間(立即處理,放置0.5及1 h)下,抑制蘭地洛爾水解的作用。通過(guò)比較樣本的質(zhì)譜響應(yīng)值發(fā)現(xiàn),1 mL全血樣本中加入2 mg·mL-1甲硫酸新斯的明溶液25 μL能夠保證全血中蘭地洛爾在室溫放置1 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 蘭地洛爾的全血濃度-時(shí)間曲線圖Fig.1 Blood concentration-time profiles of landiolol

目前文獻(xiàn)報(bào)道的蘭地洛爾血藥濃度測(cè)定方法有高效液相色譜法[4]、LC-MS/MS[5]方法,樣品處理方法為固相萃取[4]和液-液萃取[5]。筆者建立的LC-MS/MS法測(cè)定人全血中蘭地洛爾濃度,以乙腈直接沉淀蛋白為樣品預(yù)處理方法,較文獻(xiàn)報(bào)道方法簡(jiǎn)便、低耗,具有更高的分析效率,可成功地應(yīng)用于鹽酸蘭地洛爾的人體藥動(dòng)學(xué)研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.008

Determination of Landiolol Concentration in Human Blood by LC-MS/MS

YU Yun-li,ZHANG Quan-ying,HUA Wen-yan,HUANG Ming,WANG Meng
(Department of Clinical Pharmacology,the Second Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215004,China)

Objective To establish an LC-MS/MS method for the detection of landiolol concentration in human blood.MethodsAfter pretreatment with neostigmine and a deproteinization procedure,landiolol and the internal standard venlafaxine were eluted isocratically using a mobile phase consisting of acetonitrile and 10 mmoL·L-1ammonium acetate with 0.1%formic acid in a ratio of 36∶64(V/V).Separation of the respective compounds was achieved on a Waters XTerra?RP18column (150 mm×4.6 mm,5 μm).Quantitative analysis of landiolol was conducted by a triple-quadrupole mass spectrometer with positiveelectrospray ionization source,monitored under a multiple reaction monitoring(MRM)mode.The extracted ions monitored following MRM transitions werem/z510.5→423.1 for landiolol andm/z278.2→215.1 for the internal standard venlafaxine.ResultsThe calibration curve of landiolol in human blood showed good linear relationship in the range of 1.010-2 020 μg·L-1.The lower limit of quantitation was 1.010 μg·L-1.The RSD of within-day and between-day precision was less than 6.5%and 4.8%, respectively.The recovery rate was 92.6%-100.9%.ConclusionThe method is proven to be simple,rapid and reliable,and can be applied to study the pharmacokinetics of landiolol hydrochloride in healthy Chinese volunteers.

Landiolol;Drug concentration of blood;LC-MS/MS

R972.2;R969.1

A

1004-0781(2014)08-1009-04

2013-08-21

2014-01-17

*江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目(LZ13159)

俞蘊(yùn)莉(1982-),女,江蘇蘇州人,主管藥師,博士,研究方向:藥代動(dòng)力學(xué)。電話:0512-67783687,E-mail: chrisyu1255@aliyun.com。

張全英(1962-),女,江蘇蘇州人,主任藥師,學(xué)士,研究方向:臨床藥學(xué)。電話:0512-67783681,E-mail: sdfeyyq@163.com。