一種混合模式反相弱陽離子交換色譜填料的制備及其保留機(jī)理

彭西甜， 馮鈺锜

(1.生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)系，湖北武漢430072;2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，湖北武漢430064)

隨著生命科學(xué)和藥物化學(xué)的發(fā)展，針對極性帶電化合物的分離分析越來越重要，傳統(tǒng)的反相液相色譜(RPLC)在分離這類化合物時存在保留弱、峰形和選擇性差等問題，因此，亟待開發(fā)新的色譜分離方法來提高對極性帶電化合物的分離能力。近年來，結(jié)合反相疏水和離子交換保留機(jī)理的反相離子交換混合模式色譜(MMC)因可以對極性帶電分析物提供很好的保留和分離選擇性而得到了較快的發(fā)展［1－3］。反相弱陽離子交換(RP/WCX)色譜一般將羧基作為固定相表面的離子交換官能團(tuán)，隨著流動相pH值的變化，羧基官能團(tuán)的電荷狀態(tài)隨之變化，從而影響帶電分析物的保留行為，使分析物通過離子交換的保留行為更容易得到調(diào)節(jié);同時，結(jié)合疏水的保留機(jī)理，可以提供更好的分離選擇性［4］。一些商品化和新發(fā)展的混合模式RP/WCX固定相在多肽［5］、離子液體［6］、多種堿性化合物［4，7－9］等的分離中都取得了很好的效果。盡管混合模式色譜的應(yīng)用價值已經(jīng)得到了色譜工作者的普遍認(rèn)可，然而目前對其保留機(jī)理進(jìn)行定量的研究仍相對較少［10－12］。

炔基和疊氮的“點(diǎn)擊化學(xué)(click chemistry)”反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、選擇性好以及產(chǎn)率高等特點(diǎn)，色譜工作者采用該方法制備了各種性質(zhì)的色譜固定相，并取得了很好的分離效果［13－15］。在本文中，我們首先制備了辛基-疊氮官能化的混合配體硅膠材料，然后通過疊氮和丙炔酸之間的“點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)將羧基引入到硅膠表面，得到了一種混合配體辛基-羧基共同鍵合硅膠(OCS)的RP/WCX固定相材料;進(jìn)而以3種同系物陽離子表面活性劑作為探針分子，定量研究了該固定相材料混合分離模式的保留機(jī)理，該研究可對MMC的實(shí)際分離應(yīng)用提供有價值的參考;最后，將該固定相用于一系列標(biāo)準(zhǔn)化合物的分離，取得了很好的分離效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

安捷倫1200型液相色譜系統(tǒng)(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)，配有 G1311A 四元泵、G1315B DAD紫外檢測器、G1329A自動進(jìn)樣器、G1330B柱溫箱和G1322A脫氣機(jī);AVTAR-360紅外分析儀(Thermo Nicolet，Madison，USA);EL III Universal CHNOS Elemental Analyzer元素分析儀(Elementar，Germany)。

球形硅膠(5 μm粒徑，10 nm孔徑及300 m2/g比表面積)購自 Welch Materials，Inc(Maryland，US)。3-氯丙基三乙氧基硅烷(CPS)和正辛基三乙氧基硅烷(OTS)購自湖北武大有機(jī)硅新材料股份有限公司。芐基十四烷基二甲基溴化銨(BTAB)、芐基十二烷基二甲基溴化銨(BDAB)、芐基十六烷基二甲基溴化銨(BHAB)、疊氮化鈉(NaN3)和丙炔酸購自阿拉丁試劑(上海，中國)。西酞普蘭(citalopram)、氟伏沙明(fluvoxamine)、多慮平(doxepin)、丙咪嗪(imipramine)、阿米替林(amitriptyline)和氯丙咪嗪(clomipramine)以及克倫特羅(clenpenterol)、特步他林(terbutaline)、心得安(propranolol)均購自中國藥品生物制品檢定所。毒品標(biāo)準(zhǔn)品3，4-亞甲二氧基甲基苯丙胺(3，4-methylenedioxymethamphetamine)、3，4-亞甲二氧基苯丙胺(3，4-methylenedioxyamphetamine)和氯胺酮(ketamine)由北京市公安局提供。黃連素(berberine)購自百靈威。苯甲酸、聯(lián)苯、醋酸銨(NH4Ac)、異丙醇、碘化鈉、甲醇(MeOH)、丙酮、甲苯、三乙胺(NEt3)和乙腈(ACN)購自上海國藥試劑廠。實(shí)驗(yàn)所用的蒸餾水采用成都艾柯純水儀制備。

1.2 OCS固定相填料的制備

本文中用于混合模式RP/WCX的固定相材料的合成方法采用了疊氮和炔基的“點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)將羧基引入到硅膠表面，具體的合成步驟見圖1。

首先按3種不同反應(yīng)物比例制備了辛基疊氮基共同鍵合硅膠ONS。具體合成方法如下:將2.50 g活化硅膠分散在20 mL甲苯中，按照表1所示的投料比加入各個反應(yīng)物，110℃回流反應(yīng)20 h后，過濾，分別用甲苯、甲醇和丙酮洗滌3次，60℃真空干燥，備用。

其次，采用疊氮和炔基的“點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)方法將羧基鍵合到上述辛基疊氮共同鍵合硅膠ONS上。即將ONS-1、ONS-2和ONS-3分別分散在30 mL水和30 mL甲醇的混合溶劑中，加入一定量的丙炔酸(ONS-1、ONS-2、ONS-3 分別加入 0.50 g、0.20 g、0.12 g)，75℃回流反應(yīng)72 h，過濾，分別用甲醇、水和丙酮洗滌3次，得到辛基羧基共同鍵合硅膠(OCS-1、OCS-2和OCS-3)，60℃真空干燥，備用。

圖1 混合模式OCS填料的制備過程Fig.1 Schematic procedure for the preparation of mixed-mode OCS packing

表1 制備3種ONS鍵合硅膠材料所用試劑的反應(yīng)比Table 1 R eaction material ratios for the preparation of the three ONS packings

1.3 色譜柱的填裝和HPLC條件

采用密度勻漿技術(shù)，以異丙醇為勻漿劑，MeOH為淋洗劑，在41.4 MPa的壓力下，分別將OCS-1、OCS-2和OCS-3硅膠裝入150 mm×4.6 mm不銹鋼色譜柱柱管中。以不同比例的ACN/NH4Ac溶液的混合物作為流動相，流速1 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，檢測波長254 nm 或230 nm。以 NH4Ac溶液的pH值作為流動相pH值。流動相使用前采用G4砂芯漏斗過濾，超聲5 min脫氣。柱溫設(shè)為40℃，至少重復(fù)兩次進(jìn)樣。

2 結(jié)果和討論

2.1 固定相的表征

采用傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜(FT-IR)和元素分析(EA)法表征了所合成的ONS和OCS材料。以O(shè)NS-2和OCS-2的FT-IR圖為代表，在波數(shù)為2 866 cm－1和2 930 cm－1處的譜峰是C-H伸縮振動吸收峰;在ONS-2譜圖上有明顯的疊氮伸縮振動吸收峰(2 110 cm－1)，而OCS-2譜圖上疊氮吸收峰消失(見圖2)，證明了疊氮和炔基之間發(fā)生了“點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)。3種固定相的元素分析結(jié)果表明:固定相上含有碳和氮元素，從OCS-1到OCS-3碳含量逐漸增加，而氮含量逐漸降低(見表2)，符合我們初步的設(shè)想。

表2 3種OCS填料的元素分析結(jié)果Table 2 Elemental analysis results of the three OCS packings

圖2 ONS-2和OCS-2吸附劑的傅里葉轉(zhuǎn)換-紅外光譜圖Fig.2 FT-IRspectra of ONS-2 and OCS-2

2.2 保留機(jī)理的考察

在前期的工作中，我們制備了混合模式反相/強(qiáng)陽離子交換(RP/SCX)和反相/弱陰離子交換(RP/WAX)的固定相填料，并采用混合模式的單點(diǎn)和兩點(diǎn)保留機(jī)理數(shù)學(xué)模型定量研究了分析物在混合模式固定相上的保留機(jī)理，結(jié)果表明兩點(diǎn)保留機(jī)理更加符合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果［11，12］。混合模式保留機(jī)理的單點(diǎn)模型認(rèn)為在固定相的一個位點(diǎn)上同時發(fā)生反相和離子交換的保留過程，溶質(zhì)的保留是兩種相互作用的吉布斯自由能加和;而兩點(diǎn)模型認(rèn)為固定相表面存在兩種獨(dú)立的保留位點(diǎn):一部分帶電分析物同固定相的疏水官能團(tuán)發(fā)生疏水相互作用，一部分帶電分析物同固定相表面的離子官能團(tuán)發(fā)生離子相互作用，因此溶質(zhì)的保留是疏水保留和離子交換保留的加和。在單點(diǎn)模型中，保留因子同鹽濃度的倒數(shù)和對數(shù)的關(guān)系可以用下面兩個數(shù)學(xué)方程來表示［10］:

而在兩點(diǎn)模型中，這兩個關(guān)系可以表達(dá)為［10］:

已知在純離子交換過程中存在以下關(guān)系［10］:

其中，kT、kRP和kIEX分別為總的保留因子、反相的保留因子和離子交換的保留因子，CIEX為離子交換的平衡常數(shù)，［E+］m為流動相中反離子的濃度。

從方程(1)和(3)可知，不管是單點(diǎn)還是兩點(diǎn)保留機(jī)理，保留因子與流動相中鹽濃度的倒數(shù)是線性相關(guān)的，區(qū)別在于:在單點(diǎn)保留模型中斜率同離子交換的平衡常數(shù)、固定相表面的電荷數(shù)量以及反相的保留因子密切相關(guān)，截距為零;而在兩點(diǎn)保留模型中，斜率同離子交換的平衡常數(shù)以及固定相表面的電荷數(shù)量密切相關(guān)，截距為反相的保留因子。從方程(2)和(4)可以看出，在單點(diǎn)模型中分析物保留因子的對數(shù)對鹽濃度的對數(shù)作圖可以得到一條斜率約為－1的直線，而在兩點(diǎn)模型中，只有當(dāng)分析物的保留是以離子交換的保留為主時(kRP＜＜kIEX)，兩者對數(shù)關(guān)系的斜率才約等于－1。

此外，在純的RPLC中，對于同系物的探針分子，分析物反相保留因子kRP的對數(shù)和亞甲基數(shù)目nCH2存在如下線性關(guān)系［16］:

其中，KRP和φRP分別為純的RPLC平衡常數(shù)和分配比;A為logkRP對nCH2作圖所得直線的截距;而斜率B與一個亞甲基官能團(tuán)在從流動相轉(zhuǎn)移到固定相時引起的自由能的變化有關(guān)。一般來說，對于同一個RPLC固定相，不同的同系物它們的斜率B應(yīng)該是相同的［14］。因此，對于單點(diǎn)保留機(jī)理，將方程(7)代入單點(diǎn)保留機(jī)理的方程(2)，以保留因子的對數(shù)對nCH2作圖時，得到方程(8)。

其中A'為A與logCIEX之和。

從兩點(diǎn)保留機(jī)理方程(4)可知，假如疏水作用占主導(dǎo)作用(kRP?kIEX)，且離子交換作用與溶質(zhì)的疏水性無關(guān)，當(dāng)以保留因子的對數(shù)對nCH2作圖時，對所有的同系物，應(yīng)該可以得到斜率相同的直線;假如離子交換作用與溶質(zhì)的疏水性相關(guān)，或者離子交換作用對分析物的保留影響很大，那么這個公式不能作為判斷單點(diǎn)或兩點(diǎn)保留機(jī)理是否正確的依據(jù)。

本文采用3種同系物陽離子表面活性劑(結(jié)構(gòu)式如圖3所示)作為探針分子，結(jié)合混合模式的單點(diǎn)和兩點(diǎn)保留機(jī)理的數(shù)學(xué)模型，定量研究了它們在混合模式RP/WCX的OCS固定相上的保留機(jī)理，得出了單一RP或WCX作用力對總保留的影響，對混合模式色譜的實(shí)際分離應(yīng)用具有一定的理論參考價值。

圖3 3種同系物陽離子表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of three homologues of cationic surfactant

2.2.1 保留因子對數(shù)和鹽濃度對數(shù)的關(guān)系

考察了保留因子對數(shù)和鹽濃度對數(shù)的線性關(guān)系。結(jié)果顯示，所有分析物在3根色譜柱上分離時，保留因子對數(shù)和鹽濃度對數(shù)的線性關(guān)系均良好，但是斜率不等于－1，因此，不符合單點(diǎn)保留的機(jī)理(單點(diǎn)保留機(jī)理認(rèn)為所得直線的斜率為－1);而對于兩點(diǎn)保留機(jī)理，如果離子交換的保留占主導(dǎo)地位，那么該直線的斜率約等于－1。從OCS-1到OCS-3，隨著固定相疏水性的增加，所得直線的斜率與－1的偏差也越來越大，表明疏水作用對溶質(zhì)保留影響較大(見表3)。

2.2.2 保留因子和鹽濃度倒數(shù)的關(guān)系

將分析物保留因子對鹽濃度倒數(shù)進(jìn)行線性擬合，所有分析物均獲得很好的線性關(guān)系，同時得到了一個正的截距(見表4)。按照單點(diǎn)保留機(jī)理，直線的截距為零;而兩點(diǎn)保留機(jī)理認(rèn)為直線的截距等于反相的保留因子，因此正的截距表明該混合模式符合兩點(diǎn)保留機(jī)理。另外，從表4結(jié)果可知，同一根色譜柱，從BDAB到BHAB，隨著亞甲基數(shù)目的增加，直線的截距依次增大，說明疏水保留因子依次增加。直線的斜率同離子交換的平衡常數(shù)有關(guān)，從BDAB到BHAB，隨著溶質(zhì)疏水性增加，斜率也依次增加，該結(jié)果體現(xiàn)了“疏水輔助”的離子交換保留機(jī)理。而同一個分析物在不同色譜柱上的疏水保留相比較，從OCS-1到OCS-3，固定相疏水性逐漸增加，分析物的疏水保留也依次增加。

表3 鹽濃度對陽離子表面活性劑在3種OCS固定相上保留的影響*Table 3 Effect of ammonium concentration on the retention of cationic surfactants on the three OCS columns*

表4 3種同系物在OCS柱上的保留因子和流動相鹽濃度倒數(shù)的關(guān)系Table 4 Dependence of the retention factors of the three homologues on the reciprocal of ammonium concentration on the OCS columns

2.2.3 離子交換作用對總的保留的影響

根據(jù)兩點(diǎn)保留機(jī)理的數(shù)學(xué)模型，保留因子對鹽濃度倒數(shù)的線性擬合方程的截距是反相保留因子，由此，我們可以得出離子交換的保留在總的保留中所占的比例。表5結(jié)果顯示，隨著鹽濃度的增加，離子交換的保留因子降低，而疏水的保留基本不受影響，因此，離子交換在總的保留中的比例降低。而3根OCS柱相比較，由于羧基鍵合量的逐漸減小，其離子交換的保留從OCS-1到OCS-3依次減小。

從表5我們可以得到純的離子交換的保留因子，進(jìn)而驗(yàn)證離子交換保留方程(6)。表6顯示了離子交換保留因子的對數(shù)對鹽濃度的對數(shù)作圖的線性關(guān)系，在3根OCS色譜柱上線性關(guān)系都很好，且斜率基本都為－1，很符合純的離子交換的保留關(guān)系，進(jìn)一步證明了兩點(diǎn)保留機(jī)理能更加準(zhǔn)確地描述分子與固定相之間的相互作用。

表5 分析物在3種OCS柱上的保留因子對流動相鹽濃度倒數(shù)作圖的斜率和截距分析Table 5 Analysis of slopes and intercepts(kR P)of the plots of kR Pvs 1/［NH+4］for the analytes on the OCS columns

表6 分析物離子交換保留因子的對數(shù)與流動相鹽濃度對數(shù)的線性關(guān)系分析Table 6 Analysis of logkIEXvs log［NH+4］for the analytes

2.2.4 保留因子對數(shù)和分析物亞甲基數(shù)目的關(guān)系

進(jìn)一步考察了陽離子表面活性劑(BDAB、BTAB和BHAB)和烷基苯(苯、甲苯、乙苯和丙苯)兩類同系物的保留因子對數(shù)與亞甲基數(shù)目之間的關(guān)系。結(jié)果表明:鹽濃度對烷基苯的保留基本沒有影響;兩類同系物在3根色譜柱上的線性關(guān)系都很好(見表7)。由單點(diǎn)模型的方程(8)可知，兩類同系物的線性斜率應(yīng)該是相同的，然而在同一根色譜柱上，陽離子表面活性劑和烷基苯兩類同系物的線性斜率并不相同，烷基苯的斜率明顯大于陽離子表面活性劑，該結(jié)果進(jìn)一步表明了單點(diǎn)保留機(jī)理不適合描述分析物在混合模式固定相上的保留過程。而對于兩點(diǎn)保留模型，由于離子交換作用對分析物的保留影響較大，且分析物和固定相之間可能存在“疏水輔助”的離子交換位點(diǎn)，這個線性關(guān)系不適用于區(qū)分哪種保留機(jī)理更合適。

表7 兩類同系物(陽離子表面活性劑和烷基苯)的保留因子與亞甲基數(shù)目及銨離子濃度的關(guān)系考察Table 7 Study of retention factors of two types of homologues(cationic surfactants and alkylbenzenes)as function of nCH2and ammonium concentration

3 應(yīng)用

采用混合模式RP/WCX的OCS-3固定相填料分離了3種陽離子表面活性劑、6種抗抑郁藥及7種堿性溶質(zhì)分子的標(biāo)準(zhǔn)混合物，取得了很好的分離效果(見圖4)，表明該固定相具有一定的應(yīng)用前景。

圖4 (a)3種陽離子表面活性劑、(b)6種抗抑郁藥及(c)7種堿性溶質(zhì)分子在混合模式R P/WCX的OCS-3柱上的色譜圖Fig.4 Chromatograms of(a)three cationic surfactants，(b)six antidepressants and(c)seven basic solutes on the mixed-mode R P/WCX OCS-3 columnMobile phases:a.ACN/50 mmol/L NH4Ac(70∶30，v/v)at pH 5.0;b.ACN/50 mmol/L NH4Ac(40∶60，v/v)at pH 5.0;c.ACN/20 mmol/L NH4Ac(50∶50，v/v)at pH 6.0.Peaks:1.BDAB;2.BTAB;3.BHAB;4.citalopram;5.fluvoxamine;6.doxepin;7.imipramine;8.amitriptyline;9.clomipramine;10.terbutaline;11.3，4-methylenedioxyamphetamine;12.ketamine;13.3，4-methylenedioxymethamphetamine;14.clenpenterol;15.propranolol;16.berberine.

4 結(jié)論

本文采用疊氮和炔基的“點(diǎn)擊化學(xué)”反應(yīng)方法制備了一種混合配體的辛基羧基共同鍵合硅膠的固定相材料。采用陽離子表面活性劑同系物詳細(xì)考察了該混合模式RP/WCX固定相的單點(diǎn)和兩點(diǎn)保留機(jī)理，證明了兩點(diǎn)保留機(jī)理更加符合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。通過兩點(diǎn)保留機(jī)理的數(shù)學(xué)模型，得到了疏水或離子交換的單一作用力對總保留的影響，對實(shí)際樣品的分離應(yīng)用具有參考價值。最后將該混合模式的RP/WCX固定相應(yīng)用于堿性分子、陽離子表面活性劑及抗抑郁藥的分離，取得了很好的效果。

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