伴刀豆凝集素修飾磁性納米粒子富集人血清中糖蛋白及質(zhì)譜鑒定

李 鳳， 康經(jīng)武

(中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所，上海200032)

細(xì)胞中50%以上的蛋白都具有糖基化修飾［1］。作為一種普遍存在的翻譯后修飾形式，糖基化對蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有著重要影響［2］。糖蛋白參與了廣泛的生命活動(dòng)，例如蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和分選、細(xì)胞的生長和分化、細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)等［3］。異常的糖基化現(xiàn)象往往與疾病密切相關(guān)，包括癌癥和先天性糖鏈缺陷(congenital disorders of glycosylation，CDG)［4］。近年來，為了尋找疾病早期診斷和檢測的生物標(biāo)志物(biomarker)，對血液、尿液和腦脊液的廣泛性糖蛋白組學(xué)研究已被大量報(bào)道［5］。特別是針對血清樣品進(jìn)行的研究中，白蛋白、免疫球蛋白等20種高豐度蛋白占蛋白總量的99%。而許多潛在的生物標(biāo)志物蛋白含量很低，對其進(jìn)行預(yù)先富集是進(jìn)行深入研究的基礎(chǔ)［6］。

凝集素親和技術(shù)是廣泛使用的糖蛋白富集手段之一［7］。商品化的瓊脂糖作為常用基質(zhì)，硅膠粒子以及整體柱作為載體材料的研究已見諸報(bào)道［8，9］。近年來，由于磁性材料良好的磁響應(yīng)性，易于實(shí)現(xiàn)高通量，因而在生物分析領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注［10］。另外，磁性納米粒子因其具有很大的比表面積、良好的分散性和生物兼容性，成功地在微量生物樣品中實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)分子的高效富集［11］。張祥民課題組［12］采用核殼結(jié)構(gòu)的磁性微球富集復(fù)雜體系中的低豐度肽段和蛋白，大大提高了MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定肽段和蛋白的數(shù)量。Ferreira等［13］采用硅膠包裹的磁納米粒子用于體液(包括血清、尿液和唾液)中糖蛋白的富集。本課題組［14］將核殼結(jié)構(gòu)的磁性納米粒子運(yùn)用于小分子藥物靶標(biāo)蛋白的富集，獲得了豐富的免疫抑制劑環(huán)孢素A靶標(biāo)蛋白譜。

雖然磁性納米粒子在生物樣品的分析中顯示了良好的應(yīng)用前景，但其制備過程比較復(fù)雜。本文報(bào)道了一種簡易的磁性納米粒子的制備和修飾方法，只需要在一般條件下，就可以制備出高性能的磁性納米粒子用于親和富集。它具有三層的核/殼/殼結(jié)構(gòu)，由8 nm的Fe3O4磁性粒子作為內(nèi)核，以硅膠層以及種子聚合的聚縮水甘油醚甲基丙烯酸酯(PGMA)外殼(Fe3O4@SiO2@PGMA)構(gòu)成。伴刀豆凝集素通過親水的聚乙二醇連接臂共價(jià)交聯(lián)到粒子表面，用于特異性地富集人血清中的糖蛋白。采用離線的二維色譜和高分辨生物質(zhì)譜進(jìn)行分析，一共鑒定出76種糖蛋白。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

質(zhì)譜為LTQ-Orbitrap(美國Thermo公司)，離子源為 Advance nanoESI(美國 Michrom公司)，1 260 series液相色譜儀(美國Agilent公司)。數(shù)據(jù)搜索算法為SEQUEST。

三羥甲基氨基甲烷(Tris)、FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O、四乙氧基硅烷(TEOS)、Triton X-100、縮水甘油醚甲基丙烯酸酯(GMA)、甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(MPS)、過硫酸鉀(KPS)、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、4-嗎啉乙磺酸(MES)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、尿素(urea)、Tween-20、4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺(TTDA)、甲基 α-D-吡喃甘露糖苷(methyl α-D-mannopyranoside)、伴刀豆凝集素A、健康人血清樣品均購自Sigma-Aldrich(美國)。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)購自吉爾生化公司(上海)，Trypsin Gold購自Promega公司(美國)，乙腈(HPLC級)購自Merck公司(德國)，甲酸(HPLC級)購自TEDIA公司(上海)，乙醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)均為分析純。超濾管(3 kDa)，ZipTip?微量層析柱(0.6 μL，C18)購置于Millipore公司(美國)。

1.2 緩沖液的配制

富集血清中的糖蛋白時(shí)使用的結(jié)合緩沖液:20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.4)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MnCl2;洗滌緩沖液:20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.4)，500 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MnCl2和0.05%(v/v)Tween-20;洗脫緩沖液:在洗滌緩沖液中加入0.5 mol/L甲基α-D-吡喃甘露糖苷。

1.3 Fe3O4@SiO2@PGMA@ConA 的合成

伴刀豆凝集素-磁性納米粒子的合成路線如圖1所示。

1.3.1 Fe3O4@SiO2的合成

圖1 Fe3O4@SiO2@PGMA@ConA的制備流程Fig.1 Procedure for the preparation of the core-shell Fe3O4@SiO2@PGMA@ConA

稱取2.705 g FeCl3·6H2O(10.0 mmol)和0.995 g FeCl2·4H2O(5.0 mmol)，溶于 10 mL 0.4 mol/L鹽酸溶液中。在N2保護(hù)及機(jī)械攪拌下，用恒壓滴液漏斗緩慢加入100 mL氫氧化鈉水溶液(0.5 mol/L)，升溫至80℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)過程中逐漸生成黑色的鐵磁納米粒子(Fe3O4)。反應(yīng)完畢后將溶液冷卻到室溫，得到的鐵磁納米粒子依次用0.1 mol/L鹽酸和水洗滌去除雜質(zhì)，然后用水配制成100 g/L的磁性納米粒子懸浮液，4℃保存?zhèn)溆?。采用反向微乳?油包水)的sol-gel方法在磁性納米粒子表面形成硅膠包裹層。具體操作如下:在一個(gè)干燥的廣口瓶中，將123.2 mL環(huán)己烷、25.6 mL正己醇和28.32 g Triton X-100混合，機(jī)械攪拌15 min，隨即加入3.28 mL(100 g/L)的 Fe3O4粒子。之后，室溫?cái)嚢?0 min形成均勻的黑色微乳液。將1.6 mL TEOS用注射器一次性加入到上述反應(yīng)體系中，攪拌10 min使之充分溶解，然后加入0.96 mL濃氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%～27%)，室溫下攪拌反應(yīng)20 h，反應(yīng)液逐漸變成灰色。反應(yīng)完畢后，加入200 mL無水乙醇破壞微乳液體系，最后用乙醇重復(fù)洗滌4次，完全去除粒子吸附的表面活性劑。高速離心回收納米粒子，真空干燥備用。用掃描電鏡證明硅膠層包裹完整后，將300 mg Fe3O4@SiO2粒子分散到10 mL無水乙醇中，加入1 mL硅烷化試劑MPS室溫反應(yīng)24 h，在粒子表面引入雙鍵官能團(tuán)，作為下一步種子聚合反應(yīng)的起點(diǎn)。反應(yīng)結(jié)束后用乙醇洗滌，真空干燥備用。

1.3.2 Fe3O4@SiO2@PGMA 的合成

在50 mL圓底燒瓶中，加入20 mL去離子水和300 mg MPS修飾的Fe3O4@SiO2粒子，超聲波分散均勻。加入0.2 mL GMA，用氮?dú)夤呐菝摎夂?，升溫?0℃，加入0.1 mL過硫酸鉀水溶液(100 g/L)反應(yīng)12 h。反應(yīng)完畢后，磁力分離得到紅色的Fe3O4@SiO2@PGMA粒子。用水重復(fù)洗滌3次，分散于20 mL去離子水中，4℃保存。

1.4 伴刀豆凝集素的固定化

為了將伴刀豆凝集素固定到磁性納米載體表面，首先用TTDA與載體表面GMA發(fā)生環(huán)氧開環(huán)反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為方便進(jìn)一步修飾的氨基官能團(tuán)。具體操作如下:將30 mg Fe3O4@SiO2@PGMA粒子加入到0.88 mL的TTDA(0.2 mol/L)中，100℃油浴加熱回流24 h。反應(yīng)完畢冷卻至室溫，DMF重復(fù)洗滌粒子3次，將粒子最終分散于10 mL干燥的DMF中。之后，加入60 mg琥珀酸酐(0.3 mol/L)及10%(v/v)三乙胺，室溫過夜反應(yīng)。超聲條件下將其分散于50 mmol/L MES(pH=5.5)緩沖液中，加入0.25 mL EDC(10 g/L)和0.25 mL NHS(10 g/L)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h。在磁分離條件下，去除多余的EDC和NHS。將上述琥珀酰亞胺活化的粒子加入到伴刀豆凝集素溶液(2 g/L，溶于結(jié)合緩沖液)中，4℃過夜反應(yīng)。

1.5 人血清中糖蛋白的富集

超濾去除人血清樣品中的小分子，用結(jié)合緩沖液稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為0.25 g/L(BCA蛋白定量試劑盒測定)。加入5 mg Fe3O4@SiO2@PGMA@Con A粒子，在搖床上室溫孵育30 min。在磁分離條件下，用洗滌緩沖液重復(fù)洗滌3次，去除表面非特異性吸附的蛋白。之后用0.2 mL的洗脫緩沖液洗脫特異性結(jié)合的糖蛋白，重復(fù)3次。合并洗脫液，凍干備用。

1.6 胰蛋白酶酶切

將富集的蛋白溶于0.1 mL的50 mmol/L NH4HCO3、8 mol/L 尿素(pH=8.0)緩沖液中，于37℃孵育30 min。加入5 μL 200 mmol/L DTT，56℃反應(yīng)1 h。之后加入5 μL 400 mmol/L IAA，室溫避光反應(yīng)2 h。將尿素濃度稀釋至2 mmol/L后，按酶與蛋白質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶，37℃過夜酶切。

1.7 強(qiáng)陽離子交換色譜制備肽段的色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SCX(150 mm×2.1 mm，5 μm，30 nm);柱溫為25℃，流速為0.3 mL/min，檢測波長為280 nm;流動(dòng)相A為含有30%(v/v，下同)ACN 的 5 mmol/L NH4COOH(pH 3.0)水溶液，B為含有30%ACN的500 mmol/L NH4COOH(pH 6.5)水溶液。采用50 min的梯度洗脫:0～5 min，0%B;5～15 min，0% ～10%B;15～30 min，10%B ～30%B;30～43 min，30%B ～50%B;43～45 min，50%B;45.1～55 min，0%B。按時(shí)間進(jìn)行收集，每2 min收集一個(gè)組分。

1.8 質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)處理

肽段樣品脫鹽后，真空離心干燥。最終溶解于0.1%HCOOH(含2%ACN)水溶液中，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。色譜柱為Michrom Bioresources的 Magic C18 AQ(150 mm ×0.1 mm，3 μm，10 nm);進(jìn)樣量 10 μL，用自動(dòng)進(jìn)樣器(HTSPAL，CTC Analytics，Zwingen，Switzerland)以 1 μL/min的速度保持10 min。流動(dòng)相A為2%乙腈(含0.1%HCOOH)水溶液，流動(dòng)相B為98%乙腈(含0.1%HCCOH)水溶液。采用100 min的梯度洗脫:0～60 min，0%B～35%B;60～68 min，80%B;68～80 min，80%B～95%B;80～100 min，0%B。質(zhì)譜條件:正離子模式掃描，電壓1.6 kV，管狀透鏡電壓125 V;二級質(zhì)譜(MS/MS)通過數(shù)據(jù)依賴的掃描方式，以電荷數(shù)≥2的離子強(qiáng)度最強(qiáng)的10個(gè)離子為基準(zhǔn)。動(dòng)態(tài)質(zhì)量排除時(shí)間為27 s，單電荷和不帶電荷的離子不進(jìn)行MS/MS掃描，碰撞誘導(dǎo)解離能量設(shè)置為35%。

將上述分析獲取的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過SEQUEST搜索算法與人類蛋白序列數(shù)據(jù)庫(International Protein Index，IPI)進(jìn)行比對，確定肽段序列、肽段修飾位點(diǎn)及其對應(yīng)的蛋白種類。搜索引擎參數(shù)設(shè)置:MS1質(zhì)量精度±10 ppm，MS2質(zhì)量精度1 Da。檢索時(shí)每個(gè)蛋白的最小肽段數(shù)設(shè)定為2，肽段長度為6以上。Xcorr值設(shè)定:2.5(+2)、3.0(+3)、3.5(+4)。蛋白數(shù)據(jù)通過Scaffold 3 Proteome(Proteome Software，Portland，OR)軟件進(jìn)一步分析。N-糖基化位點(diǎn)的預(yù)測通過搜索NetNGlyc 1.0 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)來完成，基于蛋白序列中是否含有保守的Asn-Xaa-Ser/Thr(Xaa是除了Pro外的任意氨基酸);O-糖基化位點(diǎn)的預(yù)測通過搜索 NetOGlyc 3.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc)來完成［15］。

2 結(jié)果和討論

2.1 磁性納米粒子的表征

本實(shí)驗(yàn)中制備的核殼結(jié)構(gòu)磁性粒子的透射電鏡(TEM)照片如圖2所示。我們合成Fe3O4磁粒子核是采用均相沉淀法(也稱共沉淀法)［16］，圖2a電鏡圖表明平均粒徑為8 nm。圖2b和2c是采用反相微乳液的方法合成的Fe3O4@SiO2粒子。反相微乳液是一種由大量表面活性劑及水相和有機(jī)相組成的熱穩(wěn)定分散體系，反相微乳液是油包水微乳液體系。微乳液體系制備硅膠包裹粒子的優(yōu)點(diǎn)是良好的硅膠外形控制(表面比較光滑，粒徑均勻)及粒徑可調(diào)(改變水相和表面活性劑的比例，從而控制硅膠粒子的尺寸范圍)。從電鏡圖可以看出，F(xiàn)e3O4@SiO2粒子具有球型光滑的外形，均勻的粒徑分布，每顆硅膠包裹粒子中都含有多顆Fe3O4納米核，平均粒徑為135 nm。由于本實(shí)驗(yàn)采用共沉淀法合成的Fe3O4粒徑較小(僅為8 nm)，磁響應(yīng)較弱，無法直接使用。通過硅膠層的引入，使每個(gè)硅膠顆粒中含有多個(gè)Fe3O4納米核，大大增強(qiáng)了磁響應(yīng)性，便于后面的親和富集操作。文獻(xiàn)［10］中報(bào)道的聚合物包裹的磁性納米粒子制備較繁瑣，不易廣泛應(yīng)用。本工作中設(shè)計(jì)在硅膠表面通過種子聚合引入一層生物兼容性的聚合物PGMA，同時(shí)也引入了可修飾的環(huán)氧官能團(tuán)，制備簡單、重復(fù)性好。圖2d是表面包裹聚合物PGMA的粒子，其起始于硅膠表面的硅烷化，用硅烷化試劑MPS對硅膠表面進(jìn)行修飾，引入雙鍵作為自由基聚合的起點(diǎn)。為了得到外形良好的聚合物包裹納米粒子，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硅膠的外形控制是關(guān)鍵。電鏡圖顯示聚合物包裹層很薄，對硅膠外形的影響較小，納米粒子粒徑?jīng)]有明顯的變化。

圖2 磁性納米粒子的透射電鏡圖Fig.2 Transmission electron microscope(TEM)images of the magnetic nanoparticles(MNPs)a.Fe3O4;b and c.Fe3O4@SiO2;d.Fe3O4@SiO2@PGMA.

磁性納米粒子的紅外光譜(IR)表征如圖3所示。Fe3O4粒子的主要吸收峰是588.9 cm－1處Fe-O-Fe的特征吸收。Fe3O4@SiO2粒子在1 103.2 cm－1處有很強(qiáng)的吸收，它是Si-O-Si的特征吸收峰，證明硅膠包裹是成功的。硅膠粒子表面引入硅烷化試劑MPS會(huì)增加一些碳?xì)湓兀亲V圖中對應(yīng)的2 982.8 cm－1、2 920.9 cm－1、2 850.1 cm－13 個(gè) C-H鍵的吸收峰，吸收較弱是因?yàn)檫@些修飾分子的含量較低，只是覆蓋在硅膠表面的一層單分子層。Fe3O4@SiO2@PGMA粒子表面GMA分子的引入增加了1 722.4 cm－1處羰基的特征吸收峰，同時(shí)2 996.1 cm－1、2 956.3 cm－1、2 894.3 cm－1處的 C-H鍵吸收也明顯增強(qiáng)，證明了PGMA聚合物成功地包裹在硅膠表面。

2.2 伴刀豆凝集素的固定化

圖3 磁性納米粒子的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of the MNPsa.Fe3O4;b.Fe3O4@SiO2;c.Fe3O4@SiO2@MPS;d.Fe3O4@SiO2@PGMA.

為了實(shí)現(xiàn)伴刀豆凝集素的固定化，首先通過Fe3O4@SiO2@PGMA表面的環(huán)氧官能團(tuán)引入聚乙二醇連接臂 4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺。實(shí)驗(yàn)表明，連接臂的引入大大增加了粒子的親水性，使粒子在水相中分散性更好，同時(shí)減少了富集過程中基質(zhì)引起的非特異性吸附。粒子表面的氨基被轉(zhuǎn)化為羧基，通過EDC/NHS活化羧基實(shí)現(xiàn)伴刀豆凝集素的固定化。本實(shí)驗(yàn)中選用的伴刀豆凝集素是眾多商品化凝集素中最常用的，它可以識(shí)別構(gòu)成血清和細(xì)胞膜表面糖蛋白核心結(jié)構(gòu)中的α-甘露糖。為了確定粒子表面凝集素的固定量，通過BCA assay測定了固定化反應(yīng)前后溶液中的蛋白含量。結(jié)果表明，每毫克磁性納米粒子表面的蛋白固載量為(32±5)μg。Ferreira等［13］報(bào)道的平均粒徑為14 nm的硅膠磁性納米粒子中伴刀豆凝集素的固載量為80 μg/mg。由于蛋白固載量與納米粒子的粒徑負(fù)相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道相比本文中的蛋白固載量較低(約為文獻(xiàn)的1/3);但是本文中平均粒徑為135 nm的磁性納米粒子分散性更好，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其富集效率更高。

2.3 人血清中糖蛋白的富集和質(zhì)譜鑒定

采用本實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的伴刀豆凝集素-磁性納米載體對人血清中的特異性糖蛋白進(jìn)行富集。富集的蛋白經(jīng)過變性、還原、烷基化和胰蛋白酶酶解后，采用離線的二維色譜(SCX/RPLC)對肽段進(jìn)行分離與純化。離線的二維分離方法更靈活，可以進(jìn)行獨(dú)立的條件優(yōu)化。最終一共鑒定了80種蛋白，經(jīng)過Uniprot的檢索和在線軟件Net-NGly 1.0、NetO Gly 3.1的分析，糖蛋白一共有76種，鑒定得到的所有蛋白的相關(guān)信息見表1。與文獻(xiàn)［17］中 Agarose@Con A富集結(jié)果比較，我們在其基礎(chǔ)上多富集了48種糖蛋白。分析其原因是本文中使用的磁性納米粒子具有很大的比表面積，大大增加了粒子表面凝集素蛋白分子的密度;同時(shí)粒子親水性的聚合物表面使其在水相中分散性良好，提高了其與靶標(biāo)糖蛋白的結(jié)合效率。同時(shí)，我們鑒定的蛋白肽段覆蓋率較高，每種蛋白的平均肽段數(shù)為16，這大大增加了蛋白質(zhì)譜鑒定的可信度。我們制備的材料與文獻(xiàn)［18］中的glycobeads(非糖基化蛋白占23%)比較，非特異性吸附大大降低，分析原因是我們合成的納米粒子表面光滑，親水性的聚乙二醇連接臂減小了凝集素與糖蛋白作用的空間位阻。發(fā)展制備簡易、非特異性吸附小的磁性納米粒子對將凝集素親和技術(shù)廣泛地應(yīng)用于生物分離分析領(lǐng)域至關(guān)重要。

表1 Fe3O4@SiO2@PGMA@Con A富集的糖蛋白Table 1 Glycoproteins enriched with Fe3O4@SiO2@PGMA@Con A

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

3 結(jié)論

我們發(fā)展了一種新型磁性納米粒子，其制備簡易，分散性良好。將其與伴刀豆凝集素結(jié)合應(yīng)用于復(fù)雜體系人血清中特異性糖蛋白的富集。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的Agarose@Con A相比，本文中設(shè)計(jì)的MNP@Con A可以富集到更多特異性的糖蛋白，大大提高了富集的效率。同時(shí)蛋白鑒定結(jié)果中5%的非糖基化蛋白也強(qiáng)有力地證明了我們的磁性納米粒子非特異性吸附小。同時(shí)粒子自身的磁響應(yīng)性可以大大簡化實(shí)驗(yàn)操作、節(jié)省時(shí)間，有望實(shí)現(xiàn)高通量。凝集素作為一種天然存在的對多種糖鏈有特異性識(shí)別的生物大分子，已廣泛應(yīng)用于糖組學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

本文中的磁性納米粒子已證明是一種較理想的凝集素固定基質(zhì)，有望在更廣泛的糖組學(xué)研究中發(fā)揮作用。

［1］ Hagglund P，Bunkenborg J，Elortza F，et al.J Proteome Res，2004，3:556

［2］ Ye M L.Chinese Journal of Chromatography(葉明亮.色譜)，2013，31(1):1

［3］ Shental-Bechor D，Levy Y.Curr Opin Struct Biol，2009，19(5):524

［4］ Peracaula R，Barrabés S，Sarrats A，et al.Disease Markers，2008，25:207

［5］ Zeng X，Hood B L，Sun M，et al.J Proteome Res，2010，9(12):6440

［6］ Ma C，Pan Y T，Zhang Q，et al.Chinese Journal of Chromatography(馬成，潘一廷，張琪，等.色譜)，2013，31(11):1057

［7］ Zhao J，Qiu W L，Simeone D M，et al.J Proteome Res，2007，6:1126

［8］ Yang F，Mao J，He X W，et al.Chinese Journal of Chromatography(楊帆，毛劼，何錫文，等.色譜)，2013，31(6):531

［9］ Feng S，Yang N，Pennathur S，et al.Anal Chem，2009，81(10):3776

［10］ Aguilar-Arteaga K，Rodriguez J A，Barrado E.Anal Chim Acta，2010，674(2)，157

［11］ Wang Z，Wang C.Chinese Journal of Chromatography(王志，王春.色譜)，2012，30(10):977

［12］ Chen H M，Deng C H，Zhang X M，Angew Chem Int Ed，2010，49(3):607

［13］ Ferreira J A，Daniel-da-Silva A L，Alves R M P，et al.Anal Chem，2011，83:7035

［14］ Wei Y H，Wang T D，Liu C，et al.Chin J Chem，2013，31:715

［15］ Julenius K，Molgaard A，Gupta R，et al.Glycobiology，2004，15(2):153

［16］ Li Y C，Lin Y S，Thai P J，et al.Anal Chem，2007，79:7519

［17］ Yang Z P，Hancock W S.J Chromatogr A，2004，1053:79

［18］ Sparbier K，Asperger A，Resemann A，et al.J Biomol Tech，2007，18(4):252