高靈敏的蛋白質(zhì)免疫印跡新方法用于β-淀粉樣蛋白檢測

馮愛平，扎拉嘎胡，李威，劉英富

1.四川省德陽市第二人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，四川 德陽 61800；2.武警后勤學院 細胞生物學與醫(yī)學遺傳學教研室，天津300162

蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western印跡）是根據(jù)抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記對受檢物質(zhì)進行檢測的一種有效方法[1]，結合了凝膠分辨力高和固相免疫測定的特異敏感等多種優(yōu)點。與免疫沉淀法比較，這種方法無須對靶蛋白進行同位素標記。該方法檢測能力強，對檢測樣本的要求低，可避免溶解、聚集及靶蛋白與外來蛋白共沉淀等諸多問題[2]。

該方法的優(yōu)點是：可以從混雜抗原中檢測出特定抗原；可以從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體；可以對轉(zhuǎn)移到固相膜上的蛋白質(zhì)進行連續(xù)分析；蛋白質(zhì)反應具有均一性；固相膜保存時間長；顯色靈敏等。其不足之處：干擾因素較多；易造成結果失真；通過條帶的有無和灰度深淺來對陽性結果做出判斷有時會帶來誤差；實驗操作過程中須消耗大量昂貴抗體等。這些因素大大限制了其應用[3]。

鑒于目前Western印跡存在的局限性，我們在抗體上引入了納米金粒子（Au nanoparticles，AuNP）和氧化石墨烯（graphene oxide，GO）。這2種材料都具有制備過程簡單、比表面積大、易與蛋白質(zhì)結合、能保持抗體生物活性等優(yōu)點，在生物學方法中得到了廣泛應用。我們將抗體與AuNP和GO結合后，引入傳統(tǒng)的Western印跡方法中，逐級放大檢測信號，以降低Western印跡的檢測限，擴大該方法的適用范圍和領域[4-9]。

1 材料與方法

1.1 材料

含β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的血清來自北京腫瘤醫(yī)院；Aβ一抗（Aβ-Ab1）、辣根過氧化物酶標記的二抗（Ab2-HRP）購自Abcam公司；牛血清白蛋白（BSA）、1-乙基-3-（3-二甲基氨）-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）購自Sigma-Aldrich公司；石墨烯購自Alfa Aesar公司；氯金酸（HAuCl4·4H2O）購自南京市威圣化工貿(mào)易有限公司；檸檬酸鈉購自上海 創(chuàng) 順 化 工 有 限 公 司 ；KH2PO4、Na2HPO4、KCl、Tween-20購自北京化學試劑公司；實驗用水為雙蒸水。

Milli-Q型純水儀（≥18 MΩ，Millipore公司）；Tecnai G2 20型透射電鏡（FEI香港有限公司）；85-2數(shù)顯型恒溫攪拌器（國瑞試驗儀器廠）；SORVSLL型LEGEND MICRO 17離心機（Therno公司）。

1.2 AuNP與AuNP-Aβ-Ab1的制備

首先將l mL 1%的氯金酸溶液加入100 mL雙蒸水中，加熱至沸騰，然后迅速加入2.5 mL 1%的檸檬酸鈉溶液，充分攪拌，保持沸騰15 min。這期間溶液顏色依次由灰變藍再變紫，最后為酒紅色。移去熱源，自然冷卻至室溫，即制得平均粒徑為16 nm的AuNP顆粒，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

將0.3 mg Aβ-Ab1加入pH6.0的AuNP溶液中，室溫下攪拌2 h，然后加入2 mL 1%的BSA，室溫封閉30 min，13 300 r/min離心10 min，溶液分成上下2層，上層為未結合的抗體，下層為黑色、松軟的結合物。除去上清，用含1%BSA的PBS緩沖液將產(chǎn)物（AuNP-Aβ-Ab1）洗滌并離心3次，最后溶于PBS中，置4℃?zhèn)溆?，該產(chǎn)物能在1個月內(nèi)保持活性[10]。

1.3 GO和GO-Ab2-HRP的制備

石墨烯（又稱單層石墨或二維石墨）是單原子厚度的二維碳原子晶體，被認為是富勒烯、碳納米管和石墨的基本結構單元。石墨烯因具有大的比表面積、突出的導熱性能和力學性能，及非凡的電子傳遞性能等一系列優(yōu)異性質(zhì)，被業(yè)內(nèi)人士廣泛關注[11]。制備氧化石墨烯的方法很多，而將石墨氧化變成氧化石墨，再在超聲條件下容易得到單層的氧化石墨烯溶液，已成為氧化石墨烯制備的有效途徑。

將0.5 g石墨粉末和0.5 g硝酸鈉加入23 mL預冷的濃硫酸中，攪拌反應10 min，然后緩慢加入4 g高錳酸鉀，35℃反應1 h，再向反應體系中緩慢加入40 mL蒸餾水，95℃反應1 h，加入100 mL蒸餾水終止反應，然后加入2 mL 30%的H2O2，室溫反應2 h，將產(chǎn)物離心，并用1 L的HCl（5%）洗滌，隨后用4 L蒸餾水洗滌，離心并再次洗滌。將得到的產(chǎn)物于40℃真空干燥48 h，即為GO粉末，置4℃?zhèn)溆肹12]。

將50 mg NaOH和ClCH2COONa加入1 mL 1 mg/mL的GO中，超聲波裂解1.5 h，將產(chǎn)物GOCOOH用雙蒸水洗滌3次，除去過量的堿，然后將400 mmol/L EDC和200 mmol/L NHS一起加入1 mL pH6.0的MES緩沖液中，反應30 min，將混合物于13 300 r/min離心5 min，除去上清，此過程重復3次。將得到的GO-Ab2-HRP溶于含1%BSA的1.0 mL pH7.4 的PBS中，置4℃?zhèn)溆肹13-14]。

2 結果與討論

2.1 納米載體與抗體結合體的制備

圖1A為AuNP的透射電鏡圖，可以看出AuNP為黑色球狀物，粒徑為16 nm。圖1B為AuNP-Aβ-Ab1的透射電鏡圖，中間黑色球狀物為納米金，而包裹著納米金的絮狀物為Aβ-Ab1。為了得到分散均勻、大小勻稱的納米金顆粒，首先應將所用器皿依次用王水（濃HCl∶濃HNO3=3∶1）和雙蒸水沖洗，烘干待用。此步驟需要絕對清潔的器皿，任何雜質(zhì)都會讓形成的納米金顆粒團聚。

圖2A為GO的透射電鏡圖，圖2B為GO-Ab2-HRP的透射電鏡圖，上面的黑色斑點為結合在GO片上的抗體。為保證氧化石墨烯與二抗的結合率，又不破壞抗體的活性，在由石墨制備得到氧化石墨烯后，要用去離子水透析GO-COOH懸浮液48 h以上，以除去所有離子，因為雜質(zhì)粒子的存在對氧化石墨烯與抗體的結合會產(chǎn)生非常不利的影響。另外，加入的EDC要過量，因為EDC遇水迅速發(fā)生水解，量太少則不能發(fā)揮縮合的作用。

2.2 改進后的Western印跡方法評價

圖1 AuNP（A）和AuNP-Aβ-Ab1（B）的透射電鏡圖

圖2 GO（A）和GO-Ab2-HRP（B）的透射電鏡圖

將抗體功能化的納米金和氧化石墨烯進行Western印跡，本研究所用樣品為Aβ。Aβ是阿爾茨海默?。ˋD）中病理改變的主要成分，其毒性作用亦可誘導神經(jīng)細胞凋亡。該蛋白在腦損傷后的表達，與傷情、傷后認知功能障礙、AD及中樞神經(jīng)病理生理變化密切相關，研究其在腦外傷后腦組織中的表達情況可以判斷傷情、評估預后，對腦外傷的治療有重要意義[15]?，F(xiàn)在普遍認為Aβ的聚集在AD發(fā)生、發(fā)展過程中起核心作用，Aβ導致神經(jīng)細胞功能紊亂和死亡，最終引起癡呆[16]。

改進后Western印跡檢測Aβ的具體步驟如下。

2.2.1 樣品準備及電泳 將血清按照一定比例稀釋，同時制備2塊電泳凝膠，進行SDS-PAGE。

2.2.2 轉(zhuǎn)膜 ①電泳結束后將膠條切至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡5 min，共3次；②膜處理：預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和PVDF膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10 min；③轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙、陰極的順序放好，濾紙、凝膠、PVDF膜精確對齊，每一步都要做去除氣泡處理，接通電源，轉(zhuǎn)移1.5 h，結束后斷開電源將膜取出。

2.2.3 免疫反應 ①用0.01 mol/L PBS洗膜5 min，共3次；②加入包被液，室溫下平穩(wěn)搖動2 h；③棄包被液，用0.01 mol/L PBS洗膜5 min，共3次；④其中一塊膜加入常規(guī)一抗，另一塊加入功能化修飾過的一抗，用BSA封閉，37℃放置2 h以上；⑤棄一抗和1%BSA，用0.01 mol/L PBS洗膜3 min，共3次；⑥在步驟④中加入常規(guī)一抗的膜在本步驟中加入Ab2-HRP，加入納米金功能化修飾的一抗的膜在本步驟中加入GO-Ab2-HRP，37℃平穩(wěn)搖動1 h；⑦棄二抗，用0.01 mol/L PBS洗膜5 min，共4次；⑧加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應（圖3）。

傳統(tǒng)Western印跡方法中，每一個抗原蛋白只能結合一個對應一抗，而每個一抗也只能結合一個二抗；而在改進后的方法中，通過納米金載體與多個一抗結合，每個抗原蛋白能夠結合多個一抗；通過氧化石墨烯與二抗結合，每個一抗能連接多個酶標記二抗，通過2次串聯(lián)放大作用，能將較低的檢測信號逐級放大，提高了檢測的靈敏度。

為了考察改進后方法的性能，用與納米金顆粒結合的一抗和與氧化石墨烯結合的二抗對Aβ進行檢測，結果見圖4。改進方法比傳統(tǒng)方法多出3條帶，可檢測到濃度為16 pg/mL的樣品，檢測限降低為傳統(tǒng)方法的1/27。重復實驗結果表明，改進后的方法性能穩(wěn)定，重復性好，可用于對樣本中低濃度蛋白質(zhì)進行靈敏檢測。

2.3 結論

將納米金和氧化石墨烯引入Western印跡中，提高了一抗與抗原、二抗與一抗的結合比例，可對檢測信號逐級放大，提高了方法的靈敏度，拓展了該檢測方法的應用領域。且改進后的方法重復性好，操作簡便，將會在蛋白質(zhì)檢測和診斷學研究中發(fā)揮其應有的作用。

圖3 改進的Western印跡操作流程示意圖

圖4 改進前（A）、后（B）的Western印跡方法對Aβ的檢測結果1～7：樣品濃度依次為11 664、3888、1296、432、144、48和16 pg/mL

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