Caspase-1抑制劑對大鼠血管平滑肌細胞鈣化的初步影響

彭利靜，拓步雄，李超民

解放軍第451醫(yī)院 心血管內(nèi)科，陜西 西安 710054

動脈鈣化主要指鈣以磷酸鹽形式沉積在動脈壁組織的一種病理改變。傳統(tǒng)觀點認為血管鈣化是鈣鹽在細胞內(nèi)及細胞外基質的被動沉積，但最近的研究發(fā)現(xiàn)，血管鈣化形成的早期類似骨細胞形成，這個過程是主動、可預防、可逆轉和高度可調控的生物學過程，因此動脈鈣化發(fā)生早期的中心環(huán)節(jié)是血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）、血管周邊細胞等向成骨樣細胞的轉分化[1]。

骨保護素（osteoprotegerin，OPG）及核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear fac?tor κB ligand，RANKL）是最近發(fā)現(xiàn)的調節(jié)動脈鈣化發(fā)生的重要因子，而且有大量的細胞因子能夠調節(jié)OPG/RANKL的水平，但在動脈鈣化發(fā)生中OPG/RANKL上游信號目前尚不清楚[2]。我們前期的工作發(fā)現(xiàn)鈣化發(fā)生過程中Nalp3炎癥小體復合體的激活，提示Nalp3炎癥小體復合體可能作為其上游信號，通過改變OPG/RANKL水平來調節(jié)鈣化發(fā)生。在此，我們通過caspase-1抑制劑zVAD來抑制Nalp3炎癥小體的激活，并檢測OPG/RANKL的表達水平及其對血管平滑肌細胞鈣化的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠，體質量約150 g，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；茜素紅、β-磷酸甘油酯（β-GP）購自北京欣經(jīng)科生物技術有限公司；zVAD、反轉錄試劑盒購自Promega公司；TRIzol購自天根公司；引物由北京奧科公司合成。

1.2 血管平滑肌細胞原代分離與培養(yǎng)[3]

取SD大鼠，無菌操作取出主動脈，放入DHank's液中反復沖洗，去除殘留血液，用小鑷子剝?nèi)ネ饽?，用解剖剪縱行剪開血管，在培養(yǎng)皿中用消毒的棉簽小心擦去內(nèi)膜，用解剖剪將血管剪碎，大小為1 mm見方，將組織塊放入培養(yǎng)瓶中鋪開，間距以0.5 cm為宜，將培養(yǎng)瓶翻轉過來放入培養(yǎng)箱中靜置4～5 h，取出培養(yǎng)瓶并小心加入培養(yǎng)基至剛好覆蓋組織塊，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，1周后觀察細胞生長情況，待長至鋪滿80%時用0.25%的胰酶消化傳代，待傳入培養(yǎng)皿中靜置時吸取上清液離心重懸接種于另一培養(yǎng)皿中，如此反復多次用差速貼壁法純化細胞直至5～7代。

1.3 鈣化模型建立[2]

將原代培養(yǎng)的5～7代細胞傳代培養(yǎng)，首先用含10%血清的正常DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞長至60%左右時，加入含10 mmoL/L β-GP的DMEM培養(yǎng)基誘導鈣化，對照組則繼續(xù)用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2 d換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)10 d。

1.4 鈣化模型染色鑒定[2]

鈣化細胞棄去培養(yǎng)基，用1×PBS洗3次，六孔板中加入500 μL/孔4%多聚甲醛，37℃固定25 min，然后用去離子水洗3次，加入500 μL 1%茜素紅，室溫溫育25 min，吸去染液，用去離子水洗4次，在通風櫥中干燥2～3 min，吹干去離子水，于倒置顯微鏡下觀察鑒定并拍照記錄。

1.5 RNA提取及半定量PCR

收取鈣化不同時間點（0、2、4、6、8、10 d）的細胞，加入1 mL TRIzol裂解，用氯仿抽提RNA，異丙醇沉淀RNA，并用75%的乙醇洗滌RNA沉淀物2次，用100 μL DEPC水溶解RNA；取2 μg RNA用反轉錄試劑盒反轉錄，取2 μL反轉錄產(chǎn)物作為模板進行PCR擴增基因，擴增條件為95℃預變性5 min、95℃變性 45 s、58℃退火 30 s、72℃延伸 1 min。Rat OPG上游引物為5'-AGTTTATTTAACAGACTGCCA CCAG-3'，下游引物為5'-GTAATAAGAGGGCGCA TAGTCAGTA-3'；Rat RANKL上游引物為5'-CGCT CTGTTCCTGTACTTTCGAGCG-3'，下游引物為5'-TCGTGCTCCCTCCTTTCATCAGGTT-3'；Rat β-actin上游引物為5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'，下游引物為5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。

2 結果

2.1 caspase-1抑制劑zVAD可以下調OPG/RANKL的表達

將VSMC分為2組，一組添加zVAD，另一組不加zVAD，只加入zVAD的溶劑DMSO，2組用β-GP分別誘導 0、2、4、6、8、10 d，收取細胞裂解液提取總RNA，對OPG、RANKL進行半定量PCR檢測，并通過凝膠電泳檢測OPG及RANKL的表達，結果見圖1，單加入β-GP后OPG和RANKL等基因的轉錄水平在鈣化第2 d開始上升，但加入caspase-1抑制劑zVAD后OPG、RANKL轉錄水平降低，表明抑制炎癥小體中caspase-1的活性，能夠抑制OPG和RANKL的轉錄水平。

2.2 caspase-1抑制劑zVAD抑制動脈鈣化的程度

從圖1可以看到caspase-1抑制劑zVAD可下調OPG/RANKL的表達，接下來我們通過茜素紅鈣化染色研究caspase-1抑制劑zVAD對動脈鈣化的影響，茜素紅鈣化染色呈紅色的細胞說明發(fā)生了鈣化。結果見圖2，細胞用zVAD處理后，鈣化程度相對于未加入zVAD組明顯改善。

3 討論

圖1 caspase-1抑制劑zVAD可以下調OPG/RANKL的表達

OPG是一種分泌糖蛋白，是腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族成員，在骨的穩(wěn)態(tài)平衡中起重要的調節(jié)作用，最近發(fā)現(xiàn)OPG與血管鈣化密切相關。OPG主要在平滑肌細胞和內(nèi)皮組織細胞中表達，是RANKL和TRATL的受體，OPG與RANKL和TRATL結合[4]，抑制了RANKL和TRATL與其同族受體的結合，從而抑制了特異性前炎癥和前凋亡信號通路的活性。OPG參與血管細胞因子之間的網(wǎng)絡聯(lián)系[5]，前炎癥細胞因子如TNF-α及血小板衍化生長因子[6]在內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞中能誘導OPG表達，從而使OPG參與各種炎癥信號通路。

圖2 caspase-1抑制劑zVAD抑制動脈鈣化的程度

我們的研究發(fā)現(xiàn)，OPG在β-GP誘導的VSMC鈣化發(fā)生過程中表達上升，RANKL也有類似結果。對于OPG在鈣化發(fā)生期間持續(xù)表達，許多學者認為是一個血管代償性的防御機制，在動脈粥樣硬化或血管疾病高危情況下，為了使過度激活的炎癥通路和其他有害刺激降到正常水平而使OPG上調[7-8]。茜素紅染色顯示β-GP刺激VSMC后2 d開始出現(xiàn)明顯的鈣鹽沉積，而Nalp3炎癥小體在早期（加入β-GP 0.5 d，結果未示）就開始被激活；另外，在我們加入炎癥小體抑制劑zVAD后，OPG/RANKL的表達量增加過程減緩且鈣化程度減弱，這表明炎癥小體反應是OPG/RANKL的上游事件。這個過程中是否還存在其他的調節(jié)因子并不清楚，有待進一步研究。

[1] 程孝中,黃蓓,鐘輝.動脈鈣化發(fā)生機制研究進展[J].生物技術通訊,2010,21(1):112-115.

[2] Patricia C O.Regulation of vascular calcification by osteo?clastregulatory factorsRANKL and osteoprotegerin[J].Circ Res,2004,95:1046-1057.

[3] 張鵬,林福玉,張迎梅,等.小鼠主動脈血管平滑肌原代細胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J].生物技術通訊,2010,21(1):54-56.

[4] Emey J G,McDonnell P,Burke M B,et al.0steoprotegerin is a receptor for the cytotoxic ligand TRAIL[J].J Biol Chem,1998,273:14363-14367.

[5] Schoppet M,Preissner K T,Hobfauer L C.RANK ligand and osteoportegerin:Paracrine regulators of bone metabolism and vaseular function[J].Arterioseler Thromb Vasc Biol,2002,22:549-553.

[6] Zhang J,Fu M,Myles D,et al.PDGF induces osteoporetger?in experssion in vaseular smooth muscle cells by multiple sin?gle pathwyas[J].FEBS Lett,2002，521:180-184.

[7] Browner W S,Lui L Y,Cummings S R.Associations of se?rum osteoprotegerin levels with diabetes,stroke，bone density,fractures，and mortality in elderly women[J].J Clin Endocrinol Metab,2001,86:631-637.

[8] Jono S,Ikari Y,Shioi A,et al.Serum osteoportegerin levels are associated with the Presence and severity of coronary ar?tery disease[J].Cicrulation,2002,106:1192-1194.