人Toll樣受體9基因啟動(dòng)子區(qū)的生物信息學(xué)分析

唐亮，王燕，陳碧峰

1.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410219；2.香港中文大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)院，香港

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）是免疫過(guò)程中重要的病原體識(shí)別受體，在天然免疫和獲得性免疫過(guò)程中起重要作用[1]。TLR9屬于TLR家族，定位于內(nèi)體膜上，在序列結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性[2]。TLR9廣泛表達(dá)于機(jī)體各處組織，且具有組織特異性。在細(xì)胞水平上，TLR9主要表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞，T細(xì)胞、單核細(xì)胞等中的TLR9表達(dá)量很少。不同動(dòng)物、不同細(xì)胞群的表達(dá)水平差異較大。研究表明，免疫細(xì)胞通過(guò)TLR9識(shí)別含CpG基序的寡聚脫氧核苷酸（CpG-ODN）[3]。TLR9表達(dá)失衡可能導(dǎo)致動(dòng)物感染性疾病[4]、自身免疫性疾病[5]及腫瘤[6]等。

表觀遺傳學(xué)研究提示CpG島甲基化在基因表達(dá)調(diào)控中的重要作用，尤其是啟動(dòng)子區(qū)序列甲基化狀態(tài)對(duì)基因的表達(dá)影響深遠(yuǎn)。進(jìn)一步探討TLR9基因表達(dá)調(diào)控，有利于深入了解其在疾病發(fā)生中的生物學(xué)作用。我們利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)了TLR9基因啟動(dòng)子區(qū)，獲得了基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化區(qū)域及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位，為進(jìn)一步研究TLR9基因在疾病患者中的基因調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索人（HOMO）和小鼠（MUS）TLR9基因，ID分別為54106和81897，獲得Genbank格式文件。

在線核算數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）；序 列 對(duì) 比 BLASTN（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）；啟動(dòng)子在線分析軟件［Promoter 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）；Network Promot?er Prediction（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promot?er.html）；Promoter SCAN（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/）］；轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件（P-Match 1.0，http://www.gene-regulation.com/pub/programs.ht?ml#match）；兩序列間保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位預(yù)測(cè) 軟 件（Consite，http://asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite/）；CpG 島預(yù)測(cè)軟件（http://cpgis?lands.usc.edu/）。

1.2 方法

獲得人和小鼠TLR9基因同源序列，確定TLR9基因啟動(dòng)子區(qū)，利用上述軟件預(yù)測(cè)TLR9基因啟動(dòng)子。利用P-Match 1.0程序，核心序列相似性設(shè)定為0.80，矩陣相似性設(shè)定為 0.85，輸入 TLR9 基因上游3000 bp序列，搜索轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位，獲得啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。利用Consite程序搜索人與小鼠TLR9基因保守區(qū)，排除假陽(yáng)性結(jié)合部位。將TLR9啟動(dòng)子區(qū)域序列導(dǎo)入CpG島在線軟件進(jìn)行甲基化預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 人和小鼠TLR9基因啟動(dòng)子定位

人TLR9基因定位于染色體3p21.3，有2個(gè)外顯子、1個(gè)內(nèi)含子。轉(zhuǎn)錄mRNA的ID為NT_022517，跨越5084 bp。小鼠TLR9基因定位于染色體9F1;9，轉(zhuǎn)錄mRNA的ID為NM_031178.2，跨越4279 bp。

2.2 TLR9基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)檢索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)人TLR9基因第一外顯子上游3000 bp序列采用3種軟件預(yù)測(cè)分析，得出潛在的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)（表1）。用3種不同的在線軟件預(yù)測(cè)的TLR9基因啟動(dòng)子區(qū)域有一定的差異。用Promoter Scan程序未預(yù)測(cè)到相應(yīng)的啟動(dòng)子區(qū)域，提示可能該啟動(dòng)子缺失保守序列TATA盒。

2.3 TLR9基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析

采用P-Match 1.0程序，核心序列相似性設(shè)定為0.80，矩陣相似性設(shè)定為 0.85，輸入 TLR9 基因上游3000 bp序列，搜索庫(kù)中脊椎動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)共1434個(gè)。利用足跡法，采用Consite程序分析人與小鼠TLR9基因保守區(qū)域，對(duì)比確定保守區(qū)域中共有的轉(zhuǎn)錄因子有23個(gè)（表2）。

2.4 啟動(dòng)子CpG島預(yù)測(cè)結(jié)果

用CpG島預(yù)測(cè)軟件分析人TLR9基因啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)該序列存在長(zhǎng)度為572 bp（798～1359 bp）的CpG島，（G+C）含量為 66.4%，CpG 觀測(cè)值/預(yù)測(cè)值為0.679。見(jiàn)圖1。

3 討論

啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄所必需的一段DNA序列?；騿?dòng)子DNA的甲基化狀態(tài)及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順序決定了基因表達(dá)的時(shí)間、空間及數(shù)量等特性，也是基因表達(dá)調(diào)控的重要組成部分?，F(xiàn)階段采用實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)基因啟動(dòng)子CpG島和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的難度較大?；谏镄畔W(xué)技術(shù)，采用預(yù)測(cè)軟件，以理論預(yù)測(cè)的方法可以有效、快速地獲得基因的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)。

然而，基于各種算法的在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)啟動(dòng)子區(qū)、CpG島及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)并不完全可靠。啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)算法有多種。Promoter 2.0是基于啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄信號(hào)，如TATA盒、CAAT盒、GC盒等位置和距離的一類算法的預(yù)測(cè)軟件，而Promoter Scan是基于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位分布密度與TATA盒的權(quán)重矩陣而開(kāi)發(fā)的預(yù)測(cè)軟件。不同的算法有不同的預(yù)測(cè)結(jié)果，且存在假陽(yáng)性，須綜合考慮。

在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)中，程序只能針對(duì)已知位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)未知的、新的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)則無(wú)法分析。從人TLR9基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)到與小鼠同源的23個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，提示TLR9基因啟動(dòng)子在進(jìn)化上高度保守，為今后進(jìn)行異種轉(zhuǎn)基因及相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供了參考。

表1 TLR9基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果

表2 人TLR9基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖1 人TLR9基因啟動(dòng)子CpG島分析結(jié)果

在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化位點(diǎn)主要發(fā)生在CpG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上[7]。CpG以散在和集聚（CpG島）兩種形式存在。DNA的甲基化不僅影響基因本身的表達(dá)，而且這種影響能夠遺傳下去。而TLR9基因啟動(dòng)子區(qū)存在572 bp的CpG島，預(yù)示著此段基因序列可能與感染性疾病、自身免疫病及腫瘤等發(fā)生有關(guān)，但此結(jié)論需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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