地中海擬無枝酸菌S699電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化

王明艷++何璟

摘要：地中海擬無枝酸菌S699（Amycolatopsis mediterranei S699）能夠產(chǎn)生具有重要經(jīng)濟(jì)價值的抗生素——利福霉素B。在該菌株中建立高效的遺傳操作系統(tǒng)是研究利福霉素生物合成機(jī)制以及構(gòu)建基因工程高產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)。研究利用單因素試驗探索了供體質(zhì)粒的構(gòu)型、

關(guān)鍵詞：地中海擬無枝酸菌S699（Amycolatopsis mediterranei S699）；利福霉素B；電轉(zhuǎn)化；同源缺失

中圖分類號：Q784 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）04-0920-05

Optimizing Electroporation of Amycolatopsis mediterranei S699

WANG Ming-yan，HE Jing

（State Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract： Amycolatopsis mediterranei S699 produced an important antibiotic， rifamycin B having high economic value. To investigate biosynthetic pathway of rifamycins and construct high-yield strains by genetic engineering， establishment of a highly efficient genetic manipulation system was critically required in this strain. The effects of dsDNA and ssDNA， concentration of glycine and MgCl2 in culture medium， and electroporation parameters on electroporation efficiency were studied by single factor test. Using 34% YEME medium supplemented with 0.05 g/L glycine and 2.5 mmol/L MgCl2 to cultivate mycelia， electroporation parameters of 9 kV/cm， 25 μF and 550 Ω， double-stranded DNA as donor， a highly efficient electroporation method for A. mediterranei S699 was established with the transformation efficiency of 3.37×102 transformant/μg DNA. The homologous deletion mutant strain of the cytochrome P450 oxygenase gene orf5 from the rifamycin biosynthetic gene cluster was obtained by using the optimized method. It is demonstrated that the optimized eletroporation could be employed for genetic study on the rifamycin biosynthetic pathway.

Key words： Amycolatopsis mediterranei S699； rifamycin B； electroporation； in-frame deletion

地中海擬無枝酸菌S699（Amycolatopsis mediterranei S699）隸屬放線菌目假諾卡氏菌科擬無枝酸菌屬，為革蘭氏陽性菌，能合成并分泌利福霉素B（Rifamycin B）。利福霉素具有廣譜的抗菌作用，對革蘭氏陽性細(xì)菌，特別是對耐藥性金黃色葡萄球菌（Multiple-resistant Staphylococcus aureus）具有很強(qiáng)的抑制作用，對某些革蘭氏陰性菌的感染也有一定的治療效果[1]，同時對腫瘤和艾滋病也有很好的治療效果[2]。目前，以利福霉素SV為母核通過化學(xué)或酶學(xué)的方法合成了利福平、利福米特、利福布丁、利福噴丁、利福拉齊等利福霉素類衍生物。其中，利福布丁和利福拉齊是治療抗耐藥性疾病及抗艾滋病并發(fā)癥的有效藥物，而其他則主要用于結(jié)核和麻風(fēng)等疾病的治療[3]。

利福霉素是一種萘醌型的安莎類抗生素，由3-氨基-5-羥基苯甲酸（AHBA）起始，在Ⅰ型聚酮合酶（PKS）的作用下逐步加載延伸單元進(jìn)行碳鏈的延伸，到達(dá)合適長度時，碳鏈末端折回與起始端的氨基通過酰胺鍵連接形成大環(huán)結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)一步修飾形成終產(chǎn)物[4-6]。利福霉素最初的發(fā)酵液中有A、B、C、D、E五種組分，其中B為主要成分，后來人們又在不同產(chǎn)生菌株的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了利福霉素O、S、SV等組分。利福霉素B的活性雖然較小，但卻很容易轉(zhuǎn)化為其他活性較高的衍生物，如利福霉素O、S、SV。通過生物合成發(fā)現(xiàn)在地中海擬無枝酸菌S699中，利福霉素B作為終產(chǎn)物是由利福霉素S和SV經(jīng)后修飾加工而成[7]。利用基因工程的方法可以提高活性物質(zhì)利福霉素SV的產(chǎn)量，進(jìn)而獲得可生產(chǎn)不同利福霉素類藥物的前體物質(zhì)。而建立有效的遺傳操作系統(tǒng)則是進(jìn)行遺傳學(xué)研究及開展基因工程研究的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。雖然早期科學(xué)家借用鏈霉菌菌絲體電轉(zhuǎn)化的方法可以將外源DNA轉(zhuǎn)入地中海擬無枝酸菌S699中[5，8]，但由于轉(zhuǎn)化效率太低，不利于利福霉素合成機(jī)制的研究。因此，科學(xué)家對利福霉素類產(chǎn)生菌進(jìn)行了大量篩選，獲得了利福霉素SV的產(chǎn)生菌地中海擬無枝酸菌U-32并建立了新的電轉(zhuǎn)化法[9]。前期，課題組對這兩種電轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)基本步驟大體相同，主要區(qū)別在于后者去除了電轉(zhuǎn)化緩沖液中的磷酸緩沖液（pH 7.4）和PEG以及使用了較低的電場強(qiáng)度，從而使得電轉(zhuǎn)化效率比前者提高了一個數(shù)量級。該方法的轉(zhuǎn)化效率雖然有所提高，但仍然不能很好地滿足基因中斷和基因敲除試驗的需求。為此，本研究以地中海擬無枝酸菌U-32的電轉(zhuǎn)化法為基礎(chǔ)，對各種電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了一種高效的地中海擬無枝酸菌S699的電轉(zhuǎn)化方法，然后利用優(yōu)化后的方法對利福霉素生物合成基因簇中負(fù)責(zé)后修飾反應(yīng)的細(xì)胞色素P450氧化酶基因orf5進(jìn)行了敲除[10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 地中海擬無枝酸菌S699由美國俄勒岡州立大學(xué)Taifo Mahmud教授饋贈；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和質(zhì)粒pBluescript Ⅱ KS（-）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 大腸桿菌培養(yǎng)基為LB固體、液體培養(yǎng)基，地中海擬無枝酸菌培養(yǎng)基為TSB、34%YEME、GYM培養(yǎng)基[11]。

1.1.3 主要試劑 氨芐青霉素購自Sigma公司，潮霉素B購自Roche公司，限制性內(nèi)切酶購自Fermantas公司，KOD DNA高保真酶和T4 DNA連接酶購自TOYOBO公司，DNA Marker和rTaq DNA聚合酶購自廣州東盛生物科技有限公司，溶菌酶購自BIOSHARP公司，普通DNA凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司，TSB培養(yǎng)基購自B & D公司，其余藥品購自國藥集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pWMYD01的構(gòu)建 利用引物orf5-for-u：5′-2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pWMYD01的構(gòu)建

目前在地中海擬無枝酸菌中能夠自主復(fù)制的質(zhì)粒載體極少，文獻(xiàn)報道的地中海擬無枝酸菌的遺傳操作方法中多采用噬菌體載體系統(tǒng)[13]。經(jīng)過PCR擴(kuò)增、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)操作后，成功構(gòu)建了細(xì)胞色素P450氧化酶基因orf5同源缺失的重組質(zhì)粒pWMYD01（圖1）。該質(zhì)粒含有基因orf5上游和下游的兩個同源片段及可以在地中海擬無枝酸菌中進(jìn)行篩選的潮霉素抗性基因，沒有地中海擬無枝酸菌的復(fù)制子，進(jìn)入地中海擬無枝酸菌以后，只有通過一次同源重組反應(yīng)才能夠整合到染色體上，獲得具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。

2.2 單雙鏈DNA構(gòu)型對電轉(zhuǎn)化效率的影響

2.5 不同電場強(qiáng)度對電轉(zhuǎn)化效率的影響

2.6 不同電阻對電轉(zhuǎn)化效率的影響

2.7 orf5基因同源缺失突變菌株的構(gòu)建

3 小結(jié)與討論

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