氯通道阻斷劑DIDS對NO誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

摘要：目的探析氯通道阻斷劑DIDS對NO誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡影響。方法將培養(yǎng)12d細(xì)胞采用Hoechst33258與神經(jīng)元特異性抗體抗Neun抗體雙染方法鑒定成熟神經(jīng)元。經(jīng)過前期藥物濃度梯度監(jiān)測，確定SIN-1與DIDS的最佳濃度，最后監(jiān)測各組神經(jīng)元凋亡。結(jié)果經(jīng)過Hoechst33258與神經(jīng)元特異性抗體抗Neun抗體雙染方法鑒定定成熟神經(jīng)元純度可達(dá)到92%以上，確定SIN-1與DIDS的使用濃度為1mmol/L、0.1mmol/L。Control組有很少的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，在SIN-1組顯示有大量凋亡細(xì)胞，而在DIDS組可以觀察到少量細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)論氯通道阻斷劑DIDS可以通過某種機(jī)制減少NO誘導(dǎo)劑SIN-1誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。

關(guān)鍵詞：氯通道；DIDS；海馬研究表明細(xì)胞凋亡在許多病理性神經(jīng)細(xì)胞死亡所導(dǎo)致的疾病發(fā)揮了重要作用[1]。本實(shí)驗(yàn)用NO供體SIN-1誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡，通過觀察氯通道阻斷劑DIDS對凋亡大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響，探討氯通道在缺血性腦損傷中的作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生24h內(nèi) SD大鼠10只。

1.2主要試劑DMEM/F12高糖培養(yǎng)基，Neurobasal培養(yǎng)基，Anti-NeuN clone 抗體，熒光標(biāo)記的二抗IgG，Hoechst33258

1.3儀器雙人雙面潔凈工作臺，倒置熒光顯微鏡，二氧化碳培養(yǎng)箱

1.4海馬神經(jīng)元的鑒定參照方法用Hoechst33258和神經(jīng)元特異性抗體抗NeuN抗體雙染。倒置熒光顯微鏡下觀察并攝像。

1.5細(xì)胞凋亡的檢測DNA熒光染色是目前常用的比較簡單的觀察細(xì)胞凋亡的方法。用DNA熒光素Hoechst33258對細(xì)胞進(jìn)行染色，表現(xiàn)為正常細(xì)胞為藍(lán)色，凋亡細(xì)胞為淺藍(lán)色。每次隨機(jī)數(shù)三個(gè)視野內(nèi)200個(gè)細(xì)胞左右，記陽性細(xì)胞凋亡（%）。

2結(jié)果

2.1用Hoechst33258DNA熒光素對神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞核進(jìn)行染色（圖1a），正常海馬神經(jīng)元胞核光滑，呈卵圓形，折射出染色熒光（圖1b），用特異性的神經(jīng)元熒光標(biāo)記物體抗NeuN抗體染色后進(jìn)一步證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞主要是神經(jīng)元(1c)，占總細(xì)胞的92%以上。

圖1 正常條件下培養(yǎng)的新生SD大鼠海馬神經(jīng)元免疫熒光觀察（200X)

2.2氯通道阻斷劑對SIN-1誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損失細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察圖中觀察。在Control組有很少的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)（14.34±2.10%），而在SIN-1組顯示有大量凋亡細(xì)胞，而在DIDS組可以觀察到有少量細(xì)胞發(fā)生凋亡。方差分析顯示各組凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=245.471，P＜0.05）；LSD統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：SIN-1組與Control組相比，P＜0.05;SIN-1+DIDS組與SIN-1組相比，P＜0.05（n=6）。

Control組SIN-1組 SIN-1+DIDS組

圖2 各組離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元DNA熒光染色的形態(tài)學(xué)變化

3討論

目前認(rèn)為缺血后的遲發(fā)性神經(jīng)元的死亡主要是通過凋亡實(shí)現(xiàn)的。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SIN-1作為NO供體，可以誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符。這是由于SIN-1在水中可以分解產(chǎn)生NO和O2-并形成OONO- [2]，過量NO和OONO-的產(chǎn)生可以使NO和OONO-沿不同途徑對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用。如NO和OONO-可以破壞神經(jīng)元內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，另外NO供體能增加細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺濃度，從而抑制BCL-2基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)多種類型細(xì)胞發(fā)生凋亡。腦缺血后腦組織可以通過氧化應(yīng)激，產(chǎn)生過量的NO，從而產(chǎn)生缺血性腦損傷。

有報(bào)道，Cl-穩(wěn)態(tài)遭到破壞可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，氯通道阻斷劑DIDS能有效抑制caspase-3激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[3]。在心臟缺血再灌注損傷模型中，發(fā)現(xiàn)DIDS可以通過p13-k/Akt途徑減弱缺血再灌注損傷所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[4]。氯通道在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用目前研究較少，在STS誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠皮層和海馬神經(jīng)元凋亡模型上，氯通道阻斷劑SITS和DIDS對神經(jīng)元的凋亡具有明顯保護(hù)作用，有學(xué)者在研究鈣通道在SIN-1誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡中的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)不是鈣通道活動(dòng)而是氯通道的活動(dòng)參與了SIN-1誘導(dǎo)的神經(jīng)元的凋亡。由此，我們推斷氯通道阻斷劑DIDS可能通過某種機(jī)制干預(yù)了應(yīng)激狀態(tài)下的神經(jīng)元的凋亡過程，對神經(jīng)元起到了保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/孫杰