迷走神經(jīng)對(duì)大鼠肝細(xì)胞中NTCP表達(dá)作用的研究

摘要：目的本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立去迷走神經(jīng)肝支大鼠模型，探討迷走神經(jīng)對(duì)肝細(xì)胞功能、狀態(tài)及NTCP的表達(dá)變化的影響。方法大鼠隨機(jī)分為兩組：A組：迷走神經(jīng)肝支切斷組， B組：假手術(shù)組，每組20只。通過(guò)HE染色法光學(xué)顯微鏡下觀察切斷迷走神經(jīng)肝支后的肝臟病理形態(tài)學(xué)改變，分別通過(guò)RT-PCR及Western blotting法檢測(cè)NTCP的表達(dá)變化，來(lái)分析迷走神經(jīng)對(duì)其影響。結(jié)果去迷走神經(jīng)組中，肝臟組織NTCP mRNA和NTCP基因表達(dá)均隨著術(shù)后時(shí)間其表達(dá)明顯下降。結(jié)論在去迷走神經(jīng)肝支狀態(tài)下，肝細(xì)胞發(fā)生改變，NTCP表達(dá)水平減少，進(jìn)而影響膽鹽因子轉(zhuǎn)運(yùn)及表達(dá)。

關(guān)鍵詞：NTCP ；迷走神經(jīng)；RT-PCR；Western blotting支配肝臟的神經(jīng)分布廣泛，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞如肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞如Kupffer細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等都被交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)雙重支配著[1]。國(guó)內(nèi)外的研究表明，支配肝臟的神經(jīng)在調(diào)節(jié)肝臟血流的改變，物質(zhì)代謝以及膽道系統(tǒng)的功能方面均有重要作用。Na+?；悄懰猁}同向轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（NTCP）是肝細(xì)胞特有的一種轉(zhuǎn)運(yùn)載體，在肝小葉和肝的腺泡均有廣泛分布，膽汁酸鹽4/5的結(jié)合型?；悄懰岜烩c離子依賴性途徑所吸收，最終形成了膽鹽依賴性膽汁流，被稱為重要的膽鹽攝取系統(tǒng)[2]。

1實(shí)驗(yàn)方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康Wistar大鼠40只，雌性，清潔級(jí)動(dòng)物，體重200~220 g(佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。大鼠飼養(yǎng)于恒溫清潔環(huán)境，喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料，維持12 h晝夜節(jié)律。隨機(jī)分為以下二組：A組：迷走神經(jīng)肝支切斷組，B組：假手術(shù)組，每組20只。A組距離賁門0.5 cm分出的迷走神經(jīng)肝支并離斷；假手術(shù)組大鼠開腹后探查迷走神經(jīng)(見照片1)。各組分別在手術(shù)后第1，3，5，7，9 d剪取肝組織。分別進(jìn)行HE染色，觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)的變化。

1.2通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)NTCP mRNA 的表達(dá)變化 用Trizol液提取組織mRNA，分光光度法測(cè)定RNA的純度，采用RT-PCR技術(shù)，以β-actin為內(nèi)參，引物序列sense 5'-GTGCCATTAGCCAAGGGAATTCA

GC-3'，Antisense 5'-GCGTTCCTGTTCCACTCATAGGAGG-3'擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小為121bp；β-actinsense5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3'，Antisense 5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3?擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小為241 bp。退火溫度分別為56℃、54.7℃。用凝膠成像系統(tǒng)照像，Bandscan軟件進(jìn)行圖像分析，結(jié)果以目的區(qū)帶的光密度值積分/ 內(nèi)參區(qū)帶的光密度值積分表示，作為目的mRNA 的相對(duì)含量，進(jìn)行半定量分析。

1.3 Western blotting法檢測(cè)NTCP蛋白水平 模型制作成功后，取材大鼠肝組織并進(jìn)行總蛋白的提取，利用Pirece公司提供的組織蛋白抽提試劑盒來(lái)完成對(duì)肝組織的提取，Bradford法測(cè)定蛋白濃度后，電泳、轉(zhuǎn)膜、經(jīng)一抗、二抗后，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法來(lái)進(jìn)行底物顯影，然后用圖像分析儀來(lái)檢測(cè)X片效果，用Image Pro Plus軟件進(jìn)行相應(yīng)蛋白條帶的半定量分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析的進(jìn)行需要應(yīng)用SPSS 18.0軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，經(jīng)雙因素方差分析。P＜0.05或P＜0.01判定差異就有顯著性，P>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況 大鼠在手術(shù)后10~15 min，清醒，站立，3 h后開始進(jìn)食水。A組（n=20）術(shù)后皮毛雜亂失去光澤，活動(dòng)減少，食欲不振，體重下降，尿量減少、顏色變深，大便顏色變淺。B組（n=20）術(shù)后皮毛顏色正常，行動(dòng)如常，食量以及二便如常。

A組術(shù)后9d存活率為80%（16/20），病死的4只中麻醉意外1只，感染死亡1只，全身衰竭2只；B組術(shù)后9 d存活率為90%（18/20），病死的2只中，感染死亡1只，出血死亡1只。A組死亡率與B組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（P＜0.05）

2.2去迷走神經(jīng)肝支術(shù)后肝臟病理形態(tài)學(xué)改變 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)大體觀察，A組術(shù)后肝臟外觀輪廓稍有腫大，表面呈黃褐色，失去光華紅潤(rùn)的外表，部分可見黃色結(jié)節(jié)。B組大鼠肝臟輪廓正常，表面呈紅褐色，。HE染色顯示A組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整，肝細(xì)胞腫脹，位于中央靜脈周圍的肝細(xì)胞無(wú)折光性，棕褐色膽汁色素顆粒沉積，在術(shù)后第7、9 d可見，肝細(xì)胞內(nèi)色素顆粒增大顯著，部分肝細(xì)胞嗜酸性變及氣球樣變，點(diǎn)狀或灶狀壞死，部分肝細(xì)胞脂肪變性。匯管區(qū)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小膽管增生，膽栓形成。B組大鼠鏡下觀察，肝小葉清晰可見，中央靜脈、匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞板呈放射狀排列，未見肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞病變。

2.3 NTCP mRNA的表達(dá)變化 結(jié)果顯示，A組中NTCP mRNA隨著術(shù)后時(shí)間其表達(dá)明顯下降，半定量提示Pst 5 d時(shí)與B組相比即有差異性（P＜0.05)，至Pst 9 d時(shí)更加明顯，僅微弱表達(dá)，見表1。而B組中NTCP mRNA表達(dá)始終處于較高水平。

2.4 NTCP 蛋白的表達(dá)變化 Western Blotting 結(jié)果顯示，A組Pst1d～9d，肝組織NTCP蛋白表達(dá)水平明顯下降，以去迷走神經(jīng)肝支后第9d最低，蛋白條帶隱約可見，并且不是很完整。B組Pst1d～9d，肝組織NTCP蛋白表達(dá)水平并無(wú)明顯增高或降低，見圖1，圖2。兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

圖1 NTCP在去迷走神經(jīng)大鼠肝組織中的表達(dá)變化

圖2 NTCP在假手術(shù)組大鼠肝組織中的表達(dá)變化

3討論

人肝臟的實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞均受交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)的雙重支配，這些神經(jīng)在形態(tài)學(xué)上來(lái)說(shuō)擁有了血管動(dòng)力、感覺及代謝調(diào)節(jié)的功能。從實(shí)質(zhì)功能上來(lái)說(shuō)，支配肝臟的自主神經(jīng)其重要性可以與支配心臟的神經(jīng)相提并論。支配肝臟的迷走神經(jīng)傳入神經(jīng)的主要功能是將滲透壓、壓力感受器等這些與肝臟代謝有關(guān)的神經(jīng)沖動(dòng)被其傳送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，故將其稱為感覺神經(jīng)；支配肝臟的迷走神經(jīng)傳出神經(jīng)的主要功能是指肝內(nèi)的血流動(dòng)力、膽流和糖脂類物質(zhì)代謝等都可以被其進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的再生等也都被其所調(diào)節(jié)，故稱其為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)。

肝臟迷走神經(jīng)起著長(zhǎng)期的代謝調(diào)節(jié)作用，去迷走神經(jīng)支配的肝臟可表現(xiàn)出對(duì)糖原和去甲腎上腺素的代償性超敏感受。這些結(jié)果都提示，支配肝臟的迷走神經(jīng)有著很強(qiáng)大的調(diào)節(jié)能力。基于此，我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，首先觀察了去迷走神經(jīng)肝支對(duì)大鼠肝臟形態(tài)改變的影響。結(jié)果顯示迷走神經(jīng)離斷后，肝臟外觀輪廓稍有腫大，表面呈黃褐色，失去光華紅潤(rùn)的外表，部分可見黃色結(jié)節(jié)。通過(guò)光鏡下觀察可見大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，位于中央靜脈周圍的肝細(xì)胞沒有折光性，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)有膽汁色素顆粒沉積，在術(shù)后第7、9 d，可見色素顆粒在肝細(xì)胞內(nèi)明顯變大，有一些肝細(xì)胞發(fā)生嗜酸性變或者氣球樣變，有一些肝細(xì)胞發(fā)生壞死主要以點(diǎn)狀或灶狀為主，有一些發(fā)生脂肪變性。這樣的結(jié)果同時(shí)吸引著我們的進(jìn)一步研究，就是迷走神經(jīng)是否可以影響轉(zhuǎn)運(yùn)子基因的表達(dá)和變化，從而影響著肝臟的功能、影響著肝內(nèi)膽鹽的代謝，并影響了肝臟形態(tài)學(xué)的改變。

膽鹽的代謝是肝臟的主要功能之一，主要包括攝取、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化運(yùn)輸和向毛細(xì)膽管排泄。膽鹽、磷脂和膽固醇等膽汁主要成分的攝取及排泌主要是通過(guò)肝膽膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMTs)來(lái)完成實(shí)現(xiàn)的，NTCP 是最主要的膽鹽攝取蛋白，而BSEP則是最重要的膽鹽輸出蛋白。NTCP作為最主要的膽鹽攝取蛋白，其主要是通過(guò)跨膜梯度來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這一梯度值則是通過(guò)Na+-K+-ATP酶所產(chǎn)生。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)，在去迷走神經(jīng)肝支大鼠這組中NTCP mRNA，隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)明顯下降，半定量提示Pst 5 d時(shí)與B組相比即有差異性（P＜0.05)，至Pst 9 d時(shí)更加明顯，僅微弱表達(dá)；在蛋白水平上進(jìn)一步證實(shí)了上述變化。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都可以提示著迷走神經(jīng)影響并調(diào)節(jié)著膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子NTCP和其在肝細(xì)胞毛細(xì)膽管面上的分布，從而使得膽鹽的攝入被抑制，這充分說(shuō)明，支配肝臟的迷走神經(jīng)不僅對(duì)肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)有一定影響，而且還影響并調(diào)節(jié)著肝細(xì)胞的功能。因此，在肝臟手術(shù)中我們要避免支配肝臟迷走神經(jīng)的損傷，使得肝細(xì)胞功能被有效保護(hù)，防止膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子NTCP受損，降低肝內(nèi)膽汁淤積的發(fā)生概率，避免引起肝臟術(shù)后不必要的傷害。

參考文獻(xiàn)：

[1]張培林.神經(jīng)解剖學(xué)[M].北京人民衛(wèi)生出版社，1998:144-166.

[2]吳問漢，楊尹默，黃莚庭.膽道梗阻肝細(xì)胞膜Na+/K+-ATP酶的變化[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2003，20(2):120-122.

編輯/肖慧