思密達對大腸桿菌K88體外抑菌活性及吸附清除能力的研究

摘要：目的 探討體外思密達對大腸桿菌K88的抑菌活性及吸附清除能力。方法 利用體外抑菌實驗及吸附清除實驗研究思密達在體外對大腸桿菌的抑菌活性及吸附清除能力。結(jié)果 在體外抑菌實驗中，思密達對大腸桿菌K88的生長較對照無明顯抑制作用；而以不同濃度思密達進行的體外吸附清除實驗中，各濃度思密達處理后的大腸桿菌K88菌落形成較對照均明顯減少。結(jié)論 思密達在體外對大腸桿菌K88并無直接的抑制作用，但具明顯的吸附清除能力。

關(guān)鍵詞：思密達；大腸桿菌；抑菌；吸附清除

中圖分類號： R961 文獻標志碼： A

思密達是臨床治療成人及兒童急慢性腹瀉普遍應用的藥物，其主要成分為蒙脫石[1]。蒙脫石主要由二層共頂聯(lián)結(jié)的硅氧四面體片夾一層共棱聯(lián)結(jié)的鋁(鎂)氧(氫氧)八面體片，構(gòu)成2:1型含結(jié)晶水的硅酸鹽礦物，具有相當大的表面積（約100m2/g），其層紋狀分子結(jié)構(gòu)及非均勻性電荷分布使硅、鋁等元素被封閉在分子晶格中不易釋出[2-4]。思密達對消化道粘膜有較強的覆蓋能力，通過與粘液蛋白的相互結(jié)合，加強消化道粘膜的韌性，增強粘膜屏障，防止胃酸、胃蛋白酶、輪狀病毒、致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、幽門螺旋桿菌及其毒素對消化道粘膜的侵害，維護消化道的正常功能。同時還能對抗腐生菌叢，平衡消化道寄生菌群，提高消化道的抗攻擊能力。近年來，除了腹瀉病的治療，思密達在口腔炎與口腔潰瘍、胃炎及消化性潰瘍、小兒食管炎及胃食管反流等疾病的臨床治療中也得到了越來越廣泛的應用[5，6]。關(guān)于思密達治療相關(guān)疾病的機制，目前認為主要是通過吸附病原體及毒素，阻止病原微生物對粘膜及細胞的攻擊，促進創(chuàng)面愈合[7，8]。但是關(guān)于思密達體外抑菌及吸附病原微生物的具體研究還鮮有報道。研究思密達對大腸桿菌K88的體外抑菌及吸附清除能力，能夠為進一步闡明藥物治療機制提供證據(jù)。

1資料與方法

1.1藥品與菌株大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli）ATCC K88購自中國藥品生物制品監(jiān)察所。思密達及作為抑菌藥物陽性對照的諾佛沙星均為市售藥品，將思密達粉劑以滅菌蒸餾水配成濃度為5%（50mg/ml）的藥液，諾佛沙星以滅菌蒸餾水配成濃度為20mg/ml的藥液，備用。

1.2培養(yǎng)基配制

1.2.1牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基將蛋白胨5g，牛肉浸粉3g混合于800ml水中，完全溶解后補足水量至1000ml，調(diào)節(jié)pH至6.6~7.0，121℃，15min，高壓滅菌，備用。

1.2.2牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基將蛋白胨5g，牛肉浸粉3g，瓊脂13g混合于600ml水中，加熱煮沸至瓊脂完全溶解，補足水量至1000ml，調(diào)節(jié)pH至6.6~7.0，121℃，15min，高壓滅菌，備用。

1.3細菌懸液制備取凍存的大腸桿菌K88菌株，解凍后接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37℃搖床(80cycles/min)培養(yǎng)過夜。為獲得對數(shù)期生長的細菌，將50μl上述菌液接種于5ml新鮮牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37℃搖床中孵育至對數(shù)生長期（即細菌懸液OD600=0.4~0.6）。后續(xù)實驗均采用該細菌懸液。

1.4體外抑菌實驗取熔化的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基制備瓊脂平皿，總?cè)萘繛?5ml/平皿，思密達終濃度為0.5%；以含諾佛沙星終濃度0.2mg/ml的培養(yǎng)基作為陽性對照。將細菌懸液20μl接種于含藥培養(yǎng)基上，接種后以無菌三角刮板將菌液涂勻，置37℃細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16~24h，觀察細菌生長情況。

1.5體外吸附清除實驗取5%思密達藥液，分別以滅菌蒸餾水稀釋為1％、0.1％；分別取各稀釋度的藥液與等量菌液混勻（即藥液終濃度分別為0.5%、0.05%）；同時取滅菌生理鹽水代替藥液與等量菌液混勻作為對照。將上述混合液分別靜置于室溫下10min、60min之后，吸取上清液，再進行10倍系列稀釋，以10-4稀釋度接種平皿，每皿0.1ml。接種后以無菌三角刮板將菌液涂勻，置于37℃細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。次日觀察并計數(shù)，計算細菌清除率。以上實驗平行重復3次。

清除率（％）＝（對照平皿含菌數(shù)－實驗組含菌數(shù)）/ 對照平皿含菌數(shù)×100%

含菌數(shù)＝菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)

1.6統(tǒng)計學方法應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以（x±s）表示。計量資料的比較采用t檢驗， P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1思密達對大腸桿菌K88的體外抑制作用抑菌藥物能夠通過對細菌代謝的影響，使細菌呼吸量減低或酶系統(tǒng)受到抑制，從而使細菌不生長或部分抑制細菌生長。采用體外實驗的方法，觀察實驗藥物對細菌有無殺滅作用或抑制作用，是篩選抗菌藥物或測試藥物抗菌性能的重要手段。采用體外抑菌實驗檢測思密達在體外是否對大腸桿菌具有抑菌作用，可為其抗腹瀉作用機理和體內(nèi)的藥效研究提供依據(jù)。實驗結(jié)果表明，大腸桿菌K88在含有0.2mg/ml諾佛沙星的培養(yǎng)基中生長受到明顯抑制，而在含有0.5%思密達的培養(yǎng)基上生長正常，說明思密達在體外對大腸桿菌并無直接的殺滅或抑制作用。見圖1。

圖1思密達對大腸桿菌K88的體外抑菌作用

2.2思密達對大腸桿菌K88的體外吸附清除作用在確定思密達對大腸桿菌并無直接體外抑制作用的基礎(chǔ)上，設計體外吸附清除實驗，進一步研究藥物的抗菌機理。結(jié)果如表1所示，在進行不同時間的吸附后，作為陰性對照的生理鹽水對細菌未表現(xiàn)出吸附清除能力，但各濃度思密達對大腸桿菌的吸附清除率均達到98%以上，而吸附反應的時間及藥物濃度對細菌清除率并無顯著影響（P＞0.05）。

3討論

體外抑菌實驗表明，思密達對大腸桿菌無直接的體外抑制作用。分析其原因，可能是因為其中的有效成分蒙脫石不能與細菌充分接觸。按照本研究使用的常規(guī)體外抑菌實驗方法，思密達直接加在培養(yǎng)基中，與瓊脂及培養(yǎng)基的其他成分一起凝固，其中的蒙脫石就被相對固定，當按照常規(guī)方法進行細菌涂盤時，蒙脫石與細菌接觸的機會，就比不上蒙脫石以液體狀態(tài)在腸道中與細菌接觸的機會。所以在這種情況下，思密達不能表現(xiàn)出類似于抗生素的抑菌效果。

為了進一步說明思密達臨床抗菌應用的機理，結(jié)合蒙脫石的物理化學特性，進行了思密達的體外吸附清除實驗。由于思密達有效成分蒙脫石特殊的結(jié)構(gòu)和化學組成，其在水溶液中易形成膠體溶液，對細菌產(chǎn)生吸附固定作用。實驗結(jié)果表明，不同濃度（0.5%及0.05%）思密達在不同吸附作用時間（10min及60min）下對大腸桿菌均具有較強吸附清除能力（達98%以上），但各組間無顯著差異。有研究顯示，在體外吸附清除細菌時，如果蒙脫石用量超過0.05 mg/ml，則不同層電荷的吸附性能類同；當蒙脫石用量減少后，不同層電荷的蒙脫石的吸附量即顯示出差異，蒙脫石的層電荷密度小，吸附性能高[9，10]。

目前對于思密達抗菌機制的研究還在不斷深入。有研究表明，在人結(jié)腸癌細胞Caco-2培養(yǎng)液中加入蒙脫石，可有效降低病原菌黏附細胞的能力[11]。另有證據(jù)表明，思密達還可以保護腸黏膜免受由致病菌感染引起的組織學變化，使腸黏膜凝膠增厚、黏液增多，并延緩黏液的生存時間，維護腸道正常分泌，減少水電解質(zhì)流失，增強腸黏膜的屏障作用[12]。

綜上所述，藥物治療機制研究的不斷推進，能夠為進一步探索思密達（蒙脫石）臨床應用提供理論依據(jù)和新的思路。

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編輯/哈濤