雷公藤多苷對ACD小鼠體外培養(yǎng)T淋巴細胞亞群影響

摘要：目的探討雷公藤多苷對體外培養(yǎng)的變應性接觸性皮炎（ACD）小鼠T淋巴細胞亞群影響。方法以2，4-二硝氯苯（DNCB）制作ACD小鼠模型，分離淋巴細胞，各濃度雷公藤多苷體外作用48h后，利用流式細胞儀檢測CD3+T，CD4+T，CD8+T細胞數(shù)量。結(jié)果雷公藤多苷可以顯著抑制Th（CD4+T）細胞的表達（P＜0.01），高低濃度比較差異具有顯著性（P＜0.01），高中濃度組間、中低濃度組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。雷公藤多苷可以降低ACD小鼠體外培養(yǎng)的Tc淋巴細胞（CD8+T）數(shù)量，抑制Tc細胞的表達。雷公藤多苷高濃度可以降低ACD小鼠體外培養(yǎng)的CD3+淋巴細胞數(shù)量，抑制CD3+細胞的表達（P＜0.01）。結(jié)論雷公藤多苷可以減少成熟T淋巴細胞表達，非特異性地降低Ⅳ型變態(tài)反應主要效應細胞CD4+T及CD8+T亞群的表達，可能是雷公藤多苷治療ACD的免疫抑制機理之一。

關(guān)鍵詞：雷公藤多苷；變應性接觸性皮炎；T細胞亞群雷公藤是衛(wèi)矛科雷公藤屬的木質(zhì)藤本植物，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦，辛涼，有大毒，氣味特異，其藥用部位主要為根及根莖。雷公藤成分復雜，雷公藤多甙(又稱：雷公藤總甙)是目前臨床應用的最廣泛的雷公藤制劑之一，是雷公藤根芯部分用水和氯仿提取，經(jīng)柱色譜分離得到的一種有效組分[1]，其生物活性是由多種成分(二萜內(nèi)酯、生物堿、三萜等)協(xié)同產(chǎn)生。本項目擬通過實驗探討雷公藤多苷對變應性接觸性皮炎(ACD)小鼠體外培養(yǎng)T淋巴細胞亞群影響。

1器材

1.1動物6~8w齡昆明鼠，雄性，購自天津醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.2儀器超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司），CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司，德國）；倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)；臺式高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠，日本)；流 式 細 胞 儀(FACSCalibur型美國BD公司，美國)，

1.3試劑RPMI-1640培養(yǎng)液（Gibco公司），胎牛血清（中國醫(yī)學科學院血液病研究所），2，4-二硝氯苯（1-chloro-2:4-dinitrobenzene，DNCB）（天津市化學試劑公司），PE anti-mouse CD8（PE標記抗鼠CD8熒光抗體）；PE anti-mouse CD4（PE標記抗鼠CD4熒光抗體）；FITC anti-mouse CD3（FITC標記抗鼠CD3熒光抗體），雷公藤多苷購自浙江得恩德制藥有限公司。

2方法

2.1 ACD小鼠模型制備剪除小鼠背部3cm2鼠毛，涂抹5%DNCB；10d后，小鼠耳廓內(nèi)外兩側(cè)涂抹1% DNCB。1w后激發(fā)一次，重復四次。第四次激發(fā)后24h后觀察皮損狀況，并取背部及耳部皮膚組織病理檢查。HE染色后，觀察炎性細胞浸潤，表皮細胞間水腫、細胞內(nèi)水腫，網(wǎng)狀變性、表皮壞死，確定模型成功。

2.2 ACD小鼠淋巴細胞分離培養(yǎng)小鼠頸椎脫位處死無菌取脾臟，研磨脾臟，收集脾細胞懸液，離心懸浮細胞，計數(shù)，調(diào)整為濃度2×106/mL，然后平均分為4組，分別加入含有藥物的RPMI-1640培養(yǎng)液（藥物濃度分別為雷公藤多苷0，1，2，4μmol/L)，每組一式3孔?；靹蚝蠓湃牒?%CO2的CO2溫箱內(nèi)，37℃，培養(yǎng)48h后進行檢測。

2.3雷公藤對體外培養(yǎng)小鼠T淋巴細胞亞群影響的檢測吸取細胞， 離心，棄上清液， PBS重懸細胞入流式試管中，離心，棄上清，洗滌細胞，吸棄上清；每管分別加入5μL FITC anti-mouse CD3、5μL PE anti-mouse CD4和5μL FITC anti-mouse CD3、10μL PE anti-mouse CD8；震蕩，室溫避光保存30min；加入500μL 4%多聚甲醛，應用流式細胞儀檢測，經(jīng)488nm激光激發(fā)，依CellQuest軟件，每個樣本取10000個細胞。

2.4統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.0軟件處理，多組間兩兩比較采取單因素方差分析。

3結(jié)果

見表1，表2，表3。

雷公藤多苷可以抑制Th細胞的表達。雷公藤多苷各濃度組體均可以顯著降低體外培養(yǎng)的ACD小鼠Th淋巴細胞含量（P＜0.01），高濃度組與低濃度比較差異具有顯著性（P＜0.01），高濃度組與中濃度組、中濃度組與低濃度組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

雷公藤多苷可以降低ACD小鼠體外培養(yǎng)的Tc淋巴細胞數(shù)量，抑制Tc細胞的表達。雷公藤多苷高濃度情況下抑制Tc細胞表達與對照組比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。雷公藤多苷中濃度組與對照組、低濃度組與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而各濃度組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。

雷公藤多苷高濃度可以可以顯著降低ACD小鼠體外培養(yǎng)的CD3+淋巴細胞數(shù)量，抑制CD3+細胞的表達，（P＜0.01）。

4討論

ACD發(fā)病機理屬于Ⅳ型變態(tài)反應。外界致敏物質(zhì)與皮膚初次接觸后，與表皮的郎格罕細胞結(jié)合。當帶有抗原的郎格罕細胞刺激了在淋巴結(jié)中的未分化淋巴細胞時，使其開始分裂，并分化成致敏T淋巴細胞克隆并作為效應細胞再經(jīng)過體內(nèi)循環(huán)到皮膚。當皮膚再次接觸同一物質(zhì)時，即可被效應T淋巴細胞識別，使該細胞激活，并大量分化和釋放淋巴因子產(chǎn)生各類效應[2]。

T細胞表面的T細胞識別抗原，是鑒別和分離T細胞和T細胞亞群的重要依據(jù)。CD3分子表達在人全部T細胞上，CD4分子分布在T細胞的輔助細胞亞群表面，而CD8分子分布在抑制性T淋巴細胞和殺傷性T淋巴細胞表面，在鑒別Tc細胞亞群中有重要作用。

參與Ⅳ型超敏反應的T細胞包括CD4+和CD8+的兩個亞群， T細胞在局部擴增，直接或通過細胞因子間接損傷帶有抗原的靶細胞，導致細胞的變性和破壞[3]。有研究表明，在抗原致敏的局部皮膚，早在臨床癥狀及組織學改變出現(xiàn)以前即出現(xiàn)了CD8+T細胞的迅速聚集，而CD4+T細胞的浸潤則出現(xiàn)較晚并與皮膚炎癥反應的高峰相一致[4]。

本實驗研究顯示多苷對體外培養(yǎng)的ACD小鼠淋巴細胞Th、Tc及CD3+T的表達均有抑制作用。通過減少成熟T淋巴細胞表達，非特異性地降低Ⅳ型變態(tài)反應主要效應細胞的表達，阻止了進一步的細胞因子釋放和更多淋巴細胞的活化過程。這種對T淋巴細胞亞群非選擇性、非平衡性的抑制作用，可能使患者機體內(nèi)存在的各免疫細胞亞群之間的病理性平衡產(chǎn)生改變，使免疫系統(tǒng)的紊亂得以糾正。

參考文獻:

[1]夏志林，鄧福孝.雷公藤多甙制劑的評價[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1994，25(3):135.

[2]Carter LL，Zhang X，Dubey C，Regulation of T cell subsets from naive to memory[J].J Immunother，1998，21(3):181-187.

[3]Hamad AR，Schneck JP.Antigen-induced T cell death is regulated by CD4 expression[J].Int Rev Immunol，2001，20(5):535-546.

[4] Vocanson M， Hennino A，Cluzel-Tailhardat M，et al.CD8+ T cells are effector cells of contact dermatitis to common skin allergens in mice[J].J Invest Dermatol，2006，126(4):815-820.

編輯/申磊