比較不同培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞

摘要：目前的培養(yǎng)體系和培養(yǎng)方法中通常采用的是含10%~20%胎牛血清的培養(yǎng)基，但含血清培養(yǎng)基使臨床細胞治療受到限制，存在不安全因素。通過對臍帶間充質(zhì)干細胞在IMDM、DMEM/F12（不含酚紅）及無血清培養(yǎng)基StemProRMSC SFM的培養(yǎng)擴增，比較三種培養(yǎng)體系的優(yōu)略。建立從減血清到無血清的培養(yǎng)體系，減少血清對臨床細胞治療的干擾，提高臨床細胞治療的穩(wěn)定性與安全性。

關(guān)鍵詞：有血清培養(yǎng)基;無血清培養(yǎng)基;臍帶間充質(zhì)干細胞隨著對臍帶間充質(zhì)干細胞生物學特性及功能的深入研究，臍帶間充質(zhì)干細胞可在體外大量培養(yǎng)擴增，且生物性能穩(wěn)定，多次傳代擴增仍能保持旺盛的功能。同時臍帶間充質(zhì)干細胞還具有取材方便，無倫理學限制，免疫原性相對純凈的優(yōu)勢，可以為實驗和臨床提供足夠的細胞來源。

1資料與方法

1.1一般資料經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，采集足月剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶，無菌情況下放入含有抗生素的生理鹽水中，4℃保存，6h內(nèi)無菌處理。

1.2臍帶的分離和原代培養(yǎng)植塊法分離臍帶：用止血鉗及剪刀無菌取胎兒臍帶4~5cm，D-hank's液充分洗滌，去除臍靜脈及動脈內(nèi)的新鮮血液，分離并去除臍帶外膜組織和血管組織，獲得臍帶wharton膠。將其剪碎至1mm3組織塊，使用吸管將組織塊逐一植入T75培養(yǎng)瓶底，密度20~25塊/瓶為宜，組織小塊在瓶底要分布均勻，倒置放入37℃，體積分數(shù)為5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)。3~5h后待組織塊粘附牢固正向放置到超凈臺內(nèi)，加入適量含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，正向放入體積分數(shù)為5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)。72h后換液，一般5~7d可有間充質(zhì)干細胞爬出。

1.3臍帶間充質(zhì)干細胞在不同培養(yǎng)體系的體外擴增將原代細胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F12（不含酚紅）、StemProR MSC SFM三種培養(yǎng)體系中傳代培養(yǎng)，在生長過程中進行形態(tài)學觀察。

1.4 流式細胞儀表型檢測取生長狀態(tài)良好的P4代細胞，消化并計數(shù)，以每管1×106個細胞，分別加入10μl單克隆抗體CD73、CD34、CD45、CD105、HLA-DR、HLA-ABC及陰性對照 lgG1-PE、陽性對照lgG1-FITC，室溫避光孵育30min，PBS洗滌兩次，室溫300g，5min。PBS重懸后上流式細胞儀。

1.5 cck-8 法檢測細胞活性取生長狀態(tài)良好的P4代細胞，調(diào)整細胞濃度至0.2×105/ml，加入96孔板。每孔90μl放在37℃、體積分數(shù)為5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。7d內(nèi)每日上午10:00取出96孔板用與原來孔內(nèi)相同培養(yǎng)基100μl換液后加入cck-8溶液，繼續(xù)孵育1h。用酶標儀波長450nm測定各孔OD值。以O(shè)D值代表細胞的相對數(shù)量，繪制細胞生長曲線。

2結(jié)果

2.1細胞形態(tài)學觀察在細胞植塊5~7d可見呈纖維樣細胞從植塊邊緣爬出，散在分布或形成小克隆。2~3w細胞達到70%左右融合，細胞呈平行或旋渦狀排列。下圖為傳代培養(yǎng)至P2代細胞，1d后觀察無血清培養(yǎng)基StemProRMSC SFM和有血清DMEM/F12中臍帶間充質(zhì)干細胞的生長狀態(tài)。

2.2流式細胞表型特征流式細胞學檢測顯示，三種培養(yǎng)體系中人臍帶間充質(zhì)干細胞均不表達造血干細胞標記CD34、CD45、HLA-DR、高表達CD73、CD105、HLA-ABC。

2.3 hUC-MSCs在三種培養(yǎng)體系的生長曲線，見圖3。

圖3 hUC-MSCs在三種培養(yǎng)體系的生長曲線

3三種培養(yǎng)體系的比較

3.1 DMEM/F12培養(yǎng)基（不含酚紅）早期實驗室廣泛應(yīng)用的是Eearle's MEM即最低必需培養(yǎng)基。它是建立在平衡鹽溶液（BSS）基礎(chǔ)上的，它僅含有12種必須氨基酸、谷氨酰胺和8種維生素。成分簡單，可用于哺乳動物細胞類型的培養(yǎng)。DMEM與最低必需培養(yǎng)基相比，氨基酸含量為MEM的2倍，又添加了甘氨酸、絲氨酸等非必需氨基酸；維生素含量為MEM的四倍，同時含有酵解途徑中的重要物質(zhì)-丙酮酸和微量的鐵離子。而Ham's F12培養(yǎng)基成分復(fù)雜，含有多種微量元素，可加入少量血清培養(yǎng)，特別適合于克隆細胞的培養(yǎng)。

臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)大多使用的是DMEM/F12，它將含有較豐富成分的F12和高濃度營養(yǎng)成分的DMEM 1:1結(jié)合，配制成DMEM/F12培養(yǎng)基?？紤]到DMEM/F12可作為無血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)，且適用于血清濃度含量較低條件下哺乳動物的細胞培養(yǎng)，故本實驗使用DMEM/F12進行原代細胞的培養(yǎng)，為傳代擴增更好的適應(yīng)另兩種培養(yǎng)體系做好基礎(chǔ)。

本實驗選用不含酚紅的DMEM/F12。由于酚紅是一種實驗診斷藥，在常用的DMEM/F12培養(yǎng)基中被用作PH值的指示劑。中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。它在無血清培養(yǎng)基中會引起鈉/鉀失衡，影響細胞生長；在一些雌激素的研究表明，酚紅可以模擬固醇類雌激素作用[1]，產(chǎn)生固醇類反應(yīng)。而且在后期細胞檢測中酚紅對流式細胞檢測會產(chǎn)生干擾，因此本實驗選擇了不含酚紅的培養(yǎng)基進行原代間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)。

3.2 IMDM 培養(yǎng)基IMDM(Iscove's Modified Dubecco's Medium ) 又稱為伊思柯夫改良培養(yǎng)液。此種培養(yǎng)基含有硒、額外的氨基酸和維生素、丙酮酸鈉和HEPES，并用硝酸鉀取代了硝酸鐵；不含α-硫代甘油；不含碳酸氫鈉；含酚紅。IMDM適合高密度細胞培養(yǎng)，適用于成纖維細胞培養(yǎng)，一般加入的血清濃度為20%。

3.3無血清培養(yǎng)基StemProRMSC SFM無血清培養(yǎng)基就是在細胞培養(yǎng)中不添加血清的成分，但要添加替代血清成分的補充因子。①必需補充因子：胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉。胰島素可以促進RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，抑制細胞凋亡，是重要的細胞存活因子[2]。大多數(shù)哺乳動物細胞上存在特定的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體與轉(zhuǎn)鐵蛋白/Fe3+復(fù)合物結(jié)合是細胞獲取必需的微量元素鐵的主要來源。微量元素硒參與谷胱甘肽過氧化物歧化酶的作用過程，消除氧化物酶和氧自由基對細胞的傷害。②特殊補充因子：生長因子和激素[3]。生長因子包括表皮生長因子、成纖維細胞生長因子和神經(jīng)生長因子等。③激素除了胰島素外，大多數(shù)的哺乳動物細胞還需要一定量的其它激素如甲狀腺素、多肽類激素中的生長激素等。

3.4三種培養(yǎng)體系的比較通過細胞生長曲線我們明顯看出在含血清培養(yǎng)基中臍帶間充質(zhì)干細胞在DMEM/F12中的生長狀態(tài)要明顯高于IMDM，同時考慮到IMDM所需的血清濃度高，且含有酚紅，不利于后續(xù)操作中進行減血清到無血清的培養(yǎng)擴增及流式檢測。因此，實際比較的是DMEM/F12和StemProRMSC SFM兩種培養(yǎng)體系。不可否認血清成分多樣，對細胞生長有很大的促進作用。但同樣存在著一些風險：①取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產(chǎn)生潛在影響。②血清中含有一些對細胞有毒性的物質(zhì)，如多氨氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應(yīng)，形成有細胞毒性作用的聚精胺。③血清的使用使得實驗室和生產(chǎn)的標準化很難達到，尤其在臨床細胞治療中存在很大的風險性。④批間差異。上述情況看來無血清培養(yǎng)基是目前實驗室培養(yǎng)細胞用培養(yǎng)基的首選，但在臍帶間充質(zhì)干細胞種子細胞的培養(yǎng)中無血清培養(yǎng)基仍不能替代有血清培養(yǎng)基。因此，采用無血清培養(yǎng)最關(guān)鍵的問題是細胞從有血清培養(yǎng)基到無血清培養(yǎng)基的馴化過程。

4從有血清培養(yǎng)基到無血清培養(yǎng)基的馴化

按照細胞對無血清培養(yǎng)基的適應(yīng)性可將培養(yǎng)方法分為直接適應(yīng)法和連續(xù)適應(yīng)法。直接適應(yīng)法即細胞從添加血清的培養(yǎng)基直接轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基中；連續(xù)適應(yīng)法即分好幾步把細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基中，與直接適應(yīng)法相比，連續(xù)適應(yīng)對細胞更加溫和。本次試驗將含10%血清的DMEM/F12直接傳代至StemProRMSC SFM，通過圖3三條不同的生長曲線細胞對比顯示StemProRMSC SFM生長和增殖都較慢，證明間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)入到無血清培養(yǎng)基中需要一個適應(yīng)性的過程，更適合于連續(xù)培養(yǎng)法，將血清濃度從10%逐步減少到5%，3%，1%直到無血清培養(yǎng)。同時，無血清培養(yǎng)基對細胞的要求較高：必須是對數(shù)生長期的細胞，且活率不應(yīng)低于90%，適應(yīng)后應(yīng)該以較高的起始細胞接種；在培養(yǎng)過程中應(yīng)該對上一代的混合培養(yǎng)物備份，直到細胞適應(yīng)新的混合培養(yǎng)基。此外，在適應(yīng)過程中，不要讓細胞過度生長，這樣將增加細胞選擇亞群的可能性；需要注意的是無血清培養(yǎng)基中含有非常少的蛋白質(zhì)，更易于受外界因素的影響。間充質(zhì)干細胞從有血清培養(yǎng)基到無血清培養(yǎng)基馴化的過程不僅僅是簡單的降血清培養(yǎng)，還有很多需要探索的影響細胞生長的因素。

參考文獻：

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編輯/申磊