PCR及RT-PCR對(duì)咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的檢測(cè)探究

摘要：目的分析PCR及RT-PCR對(duì)咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的檢測(cè)結(jié)果。方法收集2013年01月~2014年01月本院收治的140例兒科門(mén)診患兒臨床資料，其中肺炎支原體患兒68例，疑似肺炎支原體患兒72例，分別采取PCR及RT-PCR方法檢測(cè)，最后分析兩種檢測(cè)方法的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果140例患兒咽拭子標(biāo)本中共檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本18例(12.85%)，共檢測(cè)出陽(yáng)性52例，占37.14%；陰性88例，占62.86%。RT-PCR測(cè)定咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的敏感度明顯高于PCR檢測(cè)，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩種方法測(cè)定咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的特異度對(duì)比，差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在140例兒科門(mén)診患兒中，≤３歲組兒童呼吸道感染陽(yáng)性率為57.86%，明顯高于≤7歲組患兒、>7歲組患兒的30.71%、11.43%，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論與PCR檢測(cè)方法對(duì)比，采取RT-PCR檢測(cè)咽拭子標(biāo)本肺炎支原體，可提高早期臨床診斷的準(zhǔn)確性，合理判斷臨床治療效果。

關(guān)鍵詞：PCR；RT-PCR；咽拭子；肺炎支原體肺炎支原體(ＭP)作為呼吸感染性臨床疾病中一種常見(jiàn)的病原體，可通過(guò)呼吸道傳播原發(fā)性非典型肺炎，此疾病發(fā)病時(shí)期為秋冬季節(jié)，發(fā)病對(duì)象大部分為嬰幼兒，患兒臨床癥狀表現(xiàn)為：持續(xù)發(fā)熱、咳嗽咳痰等[1]。肺炎支原體診斷大多是通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的檢查，臨床診斷與流行病學(xué)調(diào)查作為主要的臨床檢測(cè)手段，但在臨床檢測(cè)過(guò)程中容易受到患兒年齡、病程、機(jī)體免疫系統(tǒng)等因素的影響[2]。因此，需要進(jìn)行雙份血清檢測(cè)，才能明確區(qū)分近期Mp急性感染。但是，在臨床檢測(cè)中難以獲取雙份血清，因此，單份血清抗體檢測(cè)只能作為ＭP感染的診斷輔助手段。隨著分子生物學(xué)診斷方法的改進(jìn)，PCR檢測(cè)方法在ＭP感染早期臨床診斷中得到廣泛的應(yīng)用，在20世紀(jì)初出現(xiàn)了一種熒光實(shí)時(shí)定量PCRRT-PCR，此檢測(cè)方法加入了特異性較強(qiáng)的探針，在PCR檢測(cè)過(guò)程中明確大量致病菌的定位。為了分析PCR及RT-PCR對(duì)咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的檢測(cè)結(jié)果，本院采取PCR及RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)咽拭子標(biāo)本肺炎支原體，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料收集2013年01月~2014年01月本院收治的140例兒科門(mén)診患兒臨床資料，其中肺炎支原體患兒68例，疑似肺炎支原體患兒72例，其中男性83例，女性57例，年齡1個(gè)月~12歲，平均年齡為(3.55±1.33)歲。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集與處理所有患兒均取咽拭子，放置在1.5mlEP管中進(jìn)行攪拌，棄拭子。進(jìn)行離心1min，10000r/min，去上清，采取細(xì)菌基因組ＤＮＡ提取試劑盒，取500ul樣本提取DNA，取上清液２Ｌ作為模板。同時(shí)，應(yīng)用PCR、Rt-PCR檢測(cè)方法，將75.00ｇKH２PO４0.52ｇ，Na２HPO４1.22g，Ｌ－谷氨酸(glu)0.72gr溶于800ml去離子水中，將PH值調(diào)整到7.4，定容到1Ｌ，采取0.2m濾器抽濾除菌分裝，放置在低溫下保存。

1.2.2研究方法PCR參照文獻(xiàn)合成Mp16SrRNA基因擴(kuò)增引物[3]，終止反應(yīng)后，1u6×溴酚藍(lán)加樣緩沖液加入到5LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物樣品中，在1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳紫外燈下觀察結(jié)果。Rt－PCR試劑盒應(yīng)總體積為50ul，完成反應(yīng)后，電腦自動(dòng)采集于分析結(jié)果。

1.3診斷標(biāo)準(zhǔn)①治診標(biāo)準(zhǔn)：呼吸道癥狀和或體征Ｘ線胸片不同程度的肺部炎癥表現(xiàn)，單份血清Mp－IgM陽(yáng)性，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療顯效。②PCR診斷標(biāo)準(zhǔn)：PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物為277bp，與陽(yáng)性對(duì)照有相同條帶為Mp感染陽(yáng)性。③Rt-PCRR診斷標(biāo)準(zhǔn)：患兒咽拭子的ＤNA拷貝數(shù)1.00e+005coeiesml診斷為Mp感染陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本次研究資料均采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)數(shù)資料對(duì)比采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)經(jīng)紫外燈觀察，瓊脂糖凝膠上形成目標(biāo)片段，其大小約為277bp，即可判斷為陽(yáng)性。140例患兒咽拭子標(biāo)本中共檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本18例，占12.85%。

2.2 RT-PCR檢測(cè) 140例標(biāo)本共檢測(cè)出陽(yáng)性52例，占37.14%；陰性88例，占62.86%。

2.3對(duì)比PCR及RT-PCR測(cè)定咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的敏感度、特異度RT-PCR測(cè)定咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的敏感度為88.24%，明顯高于PCR檢測(cè)的8.82%；差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR測(cè)定咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的特異度為95.83%，與PCR檢測(cè)的91.67%對(duì)比，差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.4 Mp感染陽(yáng)性患兒不同年齡段分布結(jié)果分析在140例兒科門(mén)診患兒中，≤３歲組兒童呼吸道感染81例(57.86%)，≤7歲組患兒感染43例(30.71%)，>7歲組患兒感染16例(11.43%)，各個(gè)年齡階段陽(yáng)性率對(duì)比，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Mp感染早期診斷準(zhǔn)確率不斷提高，特別是16 SrRNA基因序列的特異性較為突出[4]。在本研究中，采取16 SrRNA基因的PCR技術(shù)，在咽拭子標(biāo)本中檢測(cè)出Mp-DNA陽(yáng)性標(biāo)本18例，占12.85%。主要是Mp感染患兒需要依據(jù)血清學(xué)檢測(cè)，年齡、病程、免疫系統(tǒng)等因素對(duì)檢測(cè)造成不同程度的影響。因此，在140例兒科門(mén)診患兒中，≤３歲組兒童呼吸道感染陽(yáng)性率為57.86%，明顯高于≤7歲組患兒、>7歲組患兒的30.71%、11.43%，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

在臨床檢測(cè)中，PCR測(cè)定咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的敏感度為8.82%，明顯低于RT-PCR測(cè)定的88.24%，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在Mp-DNA濃度低于1.00ｅ＋0.05copiesml時(shí)PCR法可能會(huì)出現(xiàn)漏診的情況。與傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)對(duì)比，RT-PCR檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)在于具有明顯的特異性、靈敏度較高、重復(fù)性良好定位準(zhǔn)確等[5]。通過(guò)以上研究表明，140例標(biāo)本利用RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，共檢測(cè)出陽(yáng)性52例，占37.14%；陰性88例，占62.86%。結(jié)果顯示RT-PCR咳嗽時(shí)間大多集中在0d~3w，與PCR檢測(cè)對(duì)比，RT-PCR檢測(cè)受到病程的影響比較小，因此，針對(duì)病程超過(guò)10d的患兒，采取RT-PCR檢測(cè)，其檢測(cè)率更高。

通過(guò)以上研究表明，RT-PCR測(cè)定咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的敏感度、特異度分別為88.24%、95.83%；PCR測(cè)定咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的敏感度、特異度分別為8.82%、91.67%，RT-PCR測(cè)定咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的敏感度明顯高于PCR檢測(cè)，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩種方法測(cè)定咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的特異度對(duì)比，差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。可見(jiàn)，在咽拭子標(biāo)本肺炎支原體的檢測(cè)中應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，有利于提高患兒早期診斷準(zhǔn)確性。

綜上所述，在咽拭子標(biāo)本肺炎支原體檢測(cè)中，全面觀察患兒病情變化，從而采取合適的檢測(cè)方法，提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，為及時(shí)治療提供個(gè)體化、針對(duì)性的治療方案，以改善患兒預(yù)后情況。

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