全人源單克隆抗體體外親和力成熟的策略

摘要：單克隆抗體已廣泛地應(yīng)用于臨床治療。人源化的單克隆抗體是目前已上市的治療性抗體的主要形式。不管是來源于雜交瘤細(xì)胞還是噬菌體展示庫的抗體， 其親和力在治療應(yīng)用上可能都需要改善?？贵w體外親和力成熟是解決這一問題的重要途徑。作者將就全人源單克隆抗體親和力成熟的策略方面進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：單克隆抗體；抗體體外親和力成熟單克隆抗體自問世以來，由于其獨(dú)有的特征已迅速應(yīng)用于醫(yī)學(xué)很多領(lǐng)域。其中人源化的單克隆抗體是目前已上市的治療性抗體的主要形式。目前獲得全人源單克隆抗體的方法主要是抗體庫技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)。但是以上方法獲得的抗體治療效果一般很難達(dá)到最佳水平，因此需要在體外進(jìn)行親和力成熟以期達(dá)到臨床應(yīng)用的要求。

抗體的體外親和力成熟是基于體內(nèi)的親和力成熟突變和選擇的原則。體外親和力成熟主要包括以下兩方面：對低親和力抗體可變區(qū)基因進(jìn)行突變的引入；有效的篩選方法。本文綜述了基于分子水平的全人源單克隆抗體體外抗體親和力成熟的研究進(jìn)展、該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀以及今后可能的發(fā)展方向。

1突變的引入

進(jìn)行體外親和力成熟的首要任務(wù)就是獲得大量突變體。因此，突變引入策略的選擇在體外親和力成熟中十分關(guān)鍵。

1.1致突變細(xì)胞株使用大腸桿菌突變細(xì)胞在目的DNA序列上隨機(jī)引入突變的方法來進(jìn)行抗體親和力成熟已經(jīng)被成功使用過了。大腸桿菌突變細(xì)胞比正常細(xì)胞造成的單堿基替換要高105倍，因?yàn)樵摷?xì)胞在DNA復(fù)制時期缺失校正性外切酶的活性。但是運(yùn)用這個方法一般需要反復(fù)選擇再放大，需要至少4~10輪連續(xù)的細(xì)菌培養(yǎng)和篩選過程，其周期和工作量非常大。

1.2易錯PCR易錯PCR(error-prone PCR)經(jīng)常被用來隨機(jī)突變產(chǎn)生突變體。這項(xiàng)技術(shù)基于分子生物學(xué)建立的標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)上進(jìn)行修改來改變和提高聚合酶錯誤率。易錯PCR的不同在于通過改變反應(yīng)緩沖液的組成來改變Taq DNA 聚合酶。文獻(xiàn)報道此方法的突變率突變的頻率在0.11%~2%[1]。不過該方法帶有一定的盲目性，在實(shí)際工作中成功率不高。近年來該技術(shù)的不斷改進(jìn)，應(yīng)用該方法進(jìn)行抗體親和力成熟的案例時有報道[2]。

1.3 DNA 重組DNA重組(DNA shuffling)是一種定向分子進(jìn)化過程，利用重組技術(shù)大大加速了可以進(jìn)化的基因速度。在過去的幾年中，DNA重組技術(shù)已經(jīng)顯著改善了。因?yàn)镈NA重組是在不同DNA物種和不同的突變之間的重組，所以可以快速增加抗體庫容量。該方法目前被廣泛應(yīng)用于進(jìn)行抗體的親和力成熟。Fermer等[3]利用該技術(shù)經(jīng)過兩輪DNA重組就把抗體親和力提高了近1000倍。

1.4鏈重組引入突變的另外一種常規(guī)方法是鏈重組(chain shuffling)。它是將VH和 VL兩條鏈中的一條鏈固定，結(jié)合庫中的另外一條鏈產(chǎn)生次級庫來尋找最優(yōu)越的配對方式。此方法操作稍繁瑣，而且輕鏈和重鏈文庫要求有一定的庫容和良好的多樣性。通過該方法進(jìn)行抗體親親和力成熟的成功報道很多。例如J.Lou所在研究組利用此方法對BoNT antibodies進(jìn)行輕鏈替換，獲得的抗體親和力較原抗體提高了77倍[4]。

1.5熱點(diǎn)突變在抗體進(jìn)化過程中，基因突變并不是隨進(jìn)在可變區(qū)內(nèi)發(fā)生突變的，而是傾向性的在CDR區(qū)的某些位置，這些部位就稱為突變熱點(diǎn)。這些突變熱點(diǎn)往往是與抗原接觸的殘基，如果將CDR區(qū)中與抗原接觸的殘基中低親和力或排斥性的殘基替換為結(jié)合方式更合適的殘基，均可以提高親和力。這種方法突變的位置更為限定，對抗體庫容量要求小，有效性高。Steidl S等通過該方法，將一株抗體親和力提高了5000倍[5]。

1.6計算機(jī)輔助定向突變計算機(jī)輔助藥物設(shè)計是以計算機(jī)化學(xué)為基礎(chǔ)，通過計算機(jī)的模擬、計算和預(yù)算藥物與受體生物大分子之間的關(guān)系，設(shè)計和優(yōu)化先導(dǎo)化合物的方法。隨著該技術(shù)不斷發(fā)展，在抗體親和力體外親和力成熟方面有了廣泛的應(yīng)用。Lippow SM在已經(jīng)獲得晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過計算機(jī)輔助設(shè)計進(jìn)行抗體親和力成熟獲得的抗體比野生型的抗體提高了140倍[6]。計算機(jī)輔助設(shè)計進(jìn)行抗體體外親和力成熟比其它方法具有明顯的優(yōu)勢，可以將突變位點(diǎn)控制在一定的范圍內(nèi)，甚至可以有目的地改變某幾個或某一個氨基酸位點(diǎn)，使親和力成熟的效率和成功率大大提高。

1.7組合應(yīng)用以上突變方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，如致突變菌株、易錯PCR、DNA重組和鏈重組引入突變都是隨機(jī)性的。前兩種在小范圍內(nèi)引入突變，后兩種能夠在較大范圍內(nèi)引入突變。熱點(diǎn)突變和計算機(jī)輔助技術(shù)可以進(jìn)行定點(diǎn)突變。其中熱點(diǎn)突變得到的突變庫太少，實(shí)用性不高。計算機(jī)輔助突變的方法能夠?qū)⑼蛔兌ㄎ挥谝恍撛诳梢蕴岣咄蛔兊奈稽c(diǎn)，針對性比以上幾種方法更強(qiáng)。一般來說，單憑一種親和力成熟的方法難以獲得親和力較大提高的抗體突變體。所以需要采取組合突變的方法來提高抗體的親和力。因此在具體實(shí)驗(yàn)中根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)情況選擇不同的方法組合。

2抗體突變體庫的構(gòu)建和篩選

抗體庫技術(shù)自問世以來在單克隆抗體體外親和力成熟領(lǐng)域的發(fā)展特別迅速?，F(xiàn)在成為開發(fā)抗體藥物最具發(fā)展活力的領(lǐng)域。展示平臺主要包括噬菌體展示抗體庫技術(shù)、核糖體展示抗體庫技術(shù)等。

噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)。同時，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。噬菌體抗體庫具有易操作，成本較低的特點(diǎn)，是目前技術(shù)最成熟、商業(yè)應(yīng)用最成功的展示平臺[7]。核糖體展示技術(shù)是將正確折疊的蛋白及其mRNA同時結(jié)合在核糖體上，形成mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聚體，使目的蛋白的基因型和表型聯(lián)系起來。核糖體展示技術(shù)克服了傳統(tǒng)篩選技術(shù)庫容量小和篩選效率低的不足，是目前可獲取庫容量最高的展示平臺[8]。但是這種展示技術(shù)操作條件與成本相對較高。

突變庫篩選的方法很多，常規(guī)的篩選方法包括抗原篩選、細(xì)胞篩選等?？乖Y選包括固相篩選和液相篩選。固相篩選是將純抗原包被在固相介質(zhì)上，然后加入待篩選的噬菌體，洗去非親和性或低親和性的噬菌體，回收高親和性的噬菌體。不足之處是抗原被固化后可能改變抗原構(gòu)象。液相篩選是將抗原與生物素基團(tuán)相連，再將其固定在包被有鏈親和素的磁珠上對噬菌體進(jìn)行篩選。缺點(diǎn)是獲得的克隆中特異性好的比例相對較低。細(xì)胞篩選類似于液相篩選，可以用表面錨定表達(dá)抗原分子的細(xì)胞作為抗原進(jìn)行篩選，也可以結(jié)合細(xì)胞展示技術(shù)，將突變庫展示在細(xì)胞表面，用抗原對細(xì)胞展示抗體庫進(jìn)行篩選。

3展望

抗體的體外親和力成熟是當(dāng)今基因工程抗體研究的熱門。現(xiàn)有的親和力成熟技術(shù)雖然能夠取得不錯的效果，但是依然存在著周期長、操作繁瑣、具有盲目性等缺點(diǎn)。目前最為有效的解決辦法是通過不同方法的組合運(yùn)用，互為補(bǔ)充，從而取得較好的效果。隨著對抗體親和力成熟機(jī)理的深入研究和生物學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，簡單有效的抗體親和力成熟方法不斷被報道。其中計算機(jī)輔助設(shè)計進(jìn)行抗體體外親和力成熟的方法，可以借助計算機(jī)分析突變位點(diǎn)、設(shè)計突變氨基酸類型，從而更有目的性地構(gòu)建突變體或突變庫，更為簡捷地獲得高親和力突變體。目前該方法越來越受到人們關(guān)注，并且取得了良好的效果。隨著計算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展和越來越多的抗體結(jié)構(gòu)被解析，計算機(jī)輔助設(shè)計進(jìn)行抗體親和力成熟必將成為抗體開發(fā)中的一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]McCullum E O， Williams B A R， Zhang J， et al. Random mutagenesis by error-prone PCR [M]//In Vitro Mutagenesis Protocols. Humana Press， 2010: 103-109.

[2]Iwai， H.， et al.， Antibody affinity maturation in vitro using unconjugated peptide antigen[J]. Protein Eng Des Sel， 2010. 23(4): p. 185-193.

[3]Fermer， C.， et al.， Specificity rescue and affinity maturation of a low-affinity IgM antibody against pro-gastrin-releasing peptide using phage display and DNA shuffling[J].Tumour Biol， 2004，25(1-2): 7-13.

[4]J.Lou， I.Geren， et al. Affinity maturation of human botulinum neurotoxin antibodies by light chain shuffling via yeast mating [J]. Protein Engineering， Design Selection， 2010， 23(4): 311-319.

[5]Steidl S， Ratsch O， Brocks B， et al. In vitro affinity maturation of human GM-CSF antibodies by targeted CDR-diversification[J].Mol Immunol，2008，46(1):135-144.

[6]LIPPOW， Shaun M.; WITTRUP， K. Dane; TIDOR， Bruce.Computational design of antibody affinity improvement beyond in vivo maturation[J].Nature biotechnology， 2007， 25(10): 1171-1176.

[7]Thie H， Meyer T， Schirrmann T， et al．Phage display derived therapeutic antibodies [J]．Curr Pharm Biotechnol， 2008，9(6):439－446．

[8]Dreier B， Plückthun A. Ribosome display: a technology for selecting and evolving proteins from large libraries [M]//PCR Protocols. Humana Press， 2011: 283-306.

編輯/哈濤